تاريخچه rflp و کلیات تکنیک !
تاريخچه RFLP
RFLP اولين بار در سال 1974 به عنوان يك ماركر ژنتيكي توسطGrodzicker و همكارانبراي تعيين جهش در ويروس به كار گرفته شد. استفاده ازRFLPبه عنوان ماركربيماري ژنتيكي‌اولين بار توسطKon و Dozy (1974) براي آناليز بيماري كم خوني‌داسي شكل به كار گرفته شد.Botstein و همكاران 1980تئوري پايه اين روش رابراي نقشه‌يابي ژنهاي مرتبط با بيماري درانسان مطرح كردند. Southern روش‌انتقال الگويDNA و پروب (كاوشگر) از ژل به‌غشاء نيتروسلولزي درRFLPرا ابداع‌كرد.
Backman (1986) براي اولين بار استفاده از اين نشانگر را مطرح‌نمود. كاربردهاي مهم همچون نقشه‌يابي و دستكاري مكانهاي ژنهاي كنترل كننده‌صفات كمي با استفاده ازRFLPدر سال1983 توسطBackman وSoller بيان گرديد. باگسترش كاربرد اين نشانگر قدرتمند چند ژن يا ژنوم‌آناليز شدند تعدادي ازگونه‌هاي دام چون گاو، گوسفند، بز، اسب، خوك و جوجه نيز با استفاده ازاين‌نشانگر آناليز شدند
كليات تكنيك
مشخص شده است كه ژنوم‌موجودات به طور طبيعي داراي تفاوتهائي در رديف بازهاي خطي مي‌باشند اين‌تغييرات طبيعي كه سبب گوناگوني در افراد يك جمعيت مي‌شود چند شكلي‌ژنتيكي‌نام دارد. اگر اين چند شكلي در رديف بازهايDNA در جايگاه شناسائي‌آنزيم محدودكننده ايجادشده باشند به راحتي قابل رديابي استRFLP . وجودالگوهاي غيريكسان است كه بر اثر هضم‌آنزيمي يك ناحيهِ خاص ازDNA بوسيلهِآنزيمهاي محدود كننده مشخص مي‌شود. اين الگوهاي‌غيريكسان به علت تفاوتDNA بسته به حضور يا عدم حضور جايگاه آنزيمهاي محدود كننده‌بوجود مي‌آيد اين‌الگوها را به دو شكل مي‌توان مشخص كرد .
- هضم آنزيمي و سپس الكتروفوز واستفاده از لكه‌گذاري ساترن
PCR فطعه مورد نظر و هضم آنزيميRFLP مستقيما روي تظاهر ژن از طريق تغيير در شكل‌گيريmRNA و ميزان و تعدادنسخه‌برداري تاثير مي‌گذارد.
آنزيمهاي محدودگر
آنزيمهاي برشي‌دسته‌اي از آنزيمهاي آندو نوكلئاز به شمار مي‌روند كه يك رديف اختصاصي ازبازها را در درون مولكولDNA دو رشته‌اي شناسائي مي‌كنند .
در سال 1970سويه‌هاي معيني از باكتري كه قادرندDNA خارجي را كه وارد سلول آن شده‌تجزيه كنند، كشف گرديد. چون با اين آنزيمها، سويه‌هاي ويژه‌اي از باكتري‌قادر بودند كه آلوده‌كنندگي فاژ يا ويروس را كاهش دهند و در واقع زمان‌ميزباني باكتري را محدود كنند به اسم آنزيم‌محدودگر ناميده مي‌شذتد. به دليل‌اهميت اين پديده و نقش كليدي آن در پيشرفت ملكولي كاشفين‌اين آنزيمهاي‌محدودگر سه نفر به اسم آلبر(Albet) )، اسميتSmith)) )، ناتنز (Nathan)بودند كه‌موفق به دريافت جايزهِ نوبل شدند در بيشتر مواقع توالي شناخته شده اين‌آنزيمها يك پاليندروم است كه معمولاإ شامل چهار شش جفت باز داراي تقارن دوطرفي است، يعني از چپ و راست به يك صورت خوانده مي‌شود.
زماني كه‌يك آنزيم برشي بهDNA اضافه مي‌شودDNA از بسياري از مكانها كه از آنهاقبلاعنوان سايت برشي ياد شد، شكاف برمي‌دارد و در اصط‌لاح هضم مي‌شود. حاصل‌فرآيند هضم،تعدادي قطعه است، در ذيل چند مثال از آنزيمهاي برشي آورده شده‌است:
در روشRFLP ابتدا نمونه‌اي ازDNAرا با يكنوع آنزيم برشي، هضم‌مي‌كنند كه در نتيجه تعداد زيادي قطعه با طول متفاوت بدست مي‌آيد، سپس اين‌قطعات با استفاده از ژل آگارز ازهمديگر جدا مي‌شوند شناسائي وتشخيص يك‌قطعه‌خاص با استفاده از كاوشگرها امكانپذير است‌كه اين عمل با استفاده ازتكنيك ديگري تحت عنوان لكه‌گذاري ساترن صورت مي‌گيرد.
پروب ياكاوشگر
قطعهِ خاصي ازDNAرا كه متعلق به توالي از يك ژن خاص‌ياcDNA مي‌باشد، بوسيله آنزيمهاي برشي خاص هضم و قطعات حاصل در حاملهايي‌پلاسميد كه توسط همان آنزيم‌محدودگر برش داده شده‌اند جاگذاري مي‌شود. اين‌پلاسميدها جهت تكثير و نگهداري به باكتريهاي‌آزمايشگاهي كه اغلب اشريشا كلي‌هستند منتقل مي‌شوند. كلونهاي ياد شده توسط راديو ايزوتوپها يامواد شيميايي‌چون بيوتين نشاندار مي‌شود. در صورت وجود همگني رديف بازي مشابه بين‌پروب‌وDNA هضم شده اتصال بين اين دو برقرار خواهدگرديد.
لكه‌گذاريSouthern
براي انجام عمل هيبرايداسيون‌لازم است كه علاوه بر قطعه كاوشگر، قطعاتDNA هضم شده نيز تك رشته‌اي شوندلذا ابتداDNA روي ژل آگارز كه حاوي قطعات هضم شده است درمحلولهاي قليائي‌مثل اوره يا فرمالدئيد يا هيدروكسيدسديم تك‌رشته مي‌نمايند. سپس صفحه‌اي‌ازغشاء نيترو سلولزي را روي قسمت فوقاني ژل قرار داده و روي آن غشاءمقداري كاغذ جاذبه الرطوبه‌مي‌گذارند محلول بافر تانك الكتروفوزر بوسيله فشاراسمزي كاغذ فوقاني بالا كشيده مي‌شود و حين‌عبور از ژل به غشاء نيترو سلولزي‌كه داراي بار مثبت است منتقل مي‌گردد. با تسهيل عمل‌هيبريداسيون بين كاوشكرو قطعاتDNA هضم شده در معرض پروب نشاندار راديواكتيو در نقاطي‌كه همولوژي‌وجود دارد هيبريد مي‌گردد. قطعاتي كه هيبريداسيون در آنها صورت نگرفته است‌ازمحيط شسته مي‌شوند و سپس از غشاي نيترو سلولزي در مجاورت فيلم عكاسي‌اتوراديوگرافي‌بعمل مي‌آيد پس از ظهور و ثبوت فيلم قطعات ويژه‌اي ازDNA كه‌با پروب هيبريد هستند به‌صورت يك باند مرئي ديده مي‌شود شكل زير مراحل‌انجام لكه‌گذاريSouthern را نشان مي‌دهد.مزايايRFLP عبارت است از موارد زيرمي‌باشد:
- تحت تاءثير محيط نيست و صددرصد ژنتيكي است
- همبارز است
- تكرار پذيري آن بالاست
PCR-RFLP) PBR)
در روش دومRFLP ، ابتدا قطعه حاوي جايگاه چند شكلي را با واكنش زنجيرهِ پلي‌مراز واستفاده‌از دو پرايمر مخصوص كه به همين منظور طراحي شده تكثير مي‌نمايند و پس ازهضم‌آنزيمي، الكتروفوز مي‌كنند. درPBR جهشهائي از نوع نقطه‌اي و حذف و اضافه‌كه باعث تغيير درسطح قطعه آنزيمي مي‌گردند قابل تشخيص است
فرق‌لكه‌گذاري ساترن وPBR
در RFLPساترن تنوعDNAدر داخل يك منطقهKb 30 محصور توسط پروب تعيين مي‌گردد در حاليكه درPBR تنوع در داخل منطقه‌اي‌كه از دو طرف به پرايمر ختم شده تعيين‌مي‌شود اين ناحيه معمولاKb2-0.5است. علاوه بر اين درPBRمزايائي چون سادگي، سرعت‌زياد، عدم نياز به موادراديواكتيو و تكرارپذيري بالا مطرح مي‌باشد
ميزان پلي‌مورفيسم و تعدادآللها درPBR كمترازRFLPساترن مي‌باشد عباسي (1376)نشانگرPBRبراي تشخيص‌پلي‌مورفيسم در ژن هورمون رشد گاوهاي هلشتاين استفاده‌كرد Aggreyوهمكاران 1999 از ماركرPBR براي تشخيص پلي مورفيسم در ناحيهِ مجاورژن گيرنده هورمون رشد در گاوهاي هلشتاين كانادا استفاده‌نمودند و الگوهاي باندي مختلفي را درروي ژل مشخص نمودند
PCR-SSCP
اين روش در سال 9891 ابداع شد. زماني كهDNAدو رشته‌اي در روي‌ژل الكتروفوز حركت داده مي‌شود. حركتDNA به اندازه قطعه بستگي داردبطوريكه مولكولهاي كوچك از منافذ ژل به‌آساني عبور مي‌كنند. درالكتروفوزSSCPابتدا از يك مادهِ دناتوره كننده (واسرشت كننده) مانند اوره‌براي‌تبديلDNA دو رشته‌اي به تك رشته‌اي استفاده مي‌شود.
در هنگام‌راندنDNA تك رشته در ژل، اثر متقابل داخل مولكولي روي مي‌دهد. به عبارتديگرDNA رشته قادر است در بخشهائي با خود باند تشكيل دهد بنابراين حركت‌مولكولها دراين حالت بيشتر به ساختار مولكوليDNA تك رشته نيز وابسته است (ساختمان سوم)
ساختمان سوم در قطعه تك رشته وابسته به توالي كل‌قطعه است اگر جهش در تواليA رخ دهد ساختار قطعه تغيير مي‌يابد. اگر پلي‌مورفيسم در قسمت آغازين محصولPCR باشدشناسائي آن باSSCP بسيار راحت‌تراست.
PCR-DGGE
DGGE يكي از روشهاي مناسب براي آشكار سازي‌جهشها است. اين روش بررسي فرآورده‌هاي زنجيره پلي‌مراز صورت مي‌گيرد. درصورتيكه قطعات رشتهDNA در يك نوكلئوتيد باهم متفاوت باشند، الگوي واسرشت‌شده متفاوتي را نشان مي‌دهند. در اين روش دو نمونهDNA دردو ستون جداگانه‌از يك ژل پلي‌اكريلاميد كه داراي نسبتي از غلظت ماده واسرشت كننده (معمولافرماميد) است، مورد الكتروفورز قرار مي‌گيرد. وقتي مولكولها به سطح‌بحراني دناتوره مي‌رسند، دورشتهDNA شروع به جدا شدن مي‌كنند در اين حالت‌كاهش معني‌داري در حركت قطعات ايجادمي‌شود. اين نقطه به عنوان نقطه ذوب‌عمل مي‌كند و باعث تاءخير در حركت مولكولDNA جهش‌يافته نسبت به فرم وحشي‌مي‌گردد
DGGE به مواد راديواكتيو و مواد شيميائي سمي احتياج ندارد ولي‌ابزار پيشرفته‌مي‌خواهد درصد تعيين موتاسيون در اين روش خيلي نزديك به 100% است. نوع مشابه‌اي از اين‌روشTGGEمي‌باشد كه در آن از حرارت بجاي غلظت موادشيميائي در ژل استفاده مي‌شود. شكلهاي پيوست چگونگي انجام تكنيكDGGE رانشان مي‌دهد.بهترين طول قطعات برايDGGE بينbp 150-1500مي‌باشد. براي‌واسرشت شدن كامل قطعات حاصل از زنجيرهِ پلي‌مراز از يك ناحيه حاوي بالاترين‌دماي ذوب مصنوعي به نامGC-clamp استفاده مي‌شود نمونه‌اي از استفاده ازماركرDGGEراي يافتن پلي مورفيسم دراگزون ده گيرندهِ هورمون رشد توسط جيGe وهمكاران (1999) انجام شده است
PCR-ARMS
روشARMS روش‌سريعي براي تعيين جهشهاي نقطه‌اي و حذف و اضافه‌ها است. اين روش اولين بارتوسطNewton و)Groham 1994 (براي آناليز بازهاي متفاوت دروالدين حاوي كمبودآنتي‌ترپيسين و همچنين براي تشخيص والدين ناقل بيماري سيستيك‌فيبروزيس وبتاتالاسمي بكار گرفته شد.
اين تكنيك براساس طراحي پرايمرهاي‌اختصاصي آللها درPCRمي‌باشد. براي تشخيص يك جهش ويژه، دو پرايمر كنترل درنزديكي محل موتاسيون براي اطمينان از عمل صحيحPCR طراحي مي‌شود. براي‌تكثير منطقهِ حاوي جهش نيز يك پرايمر مشترك براي الل موتانت ووحشي‌طراحي‌مي‌گردد. دو پرايمر باقي مانده همان پرايمرهايARMS مي‌باشد كه بازَ3 آنها به‌ترتيب مكمل توالي الل موتانت و الل وحشي هستند. چنانچه‌پرايمرARMSداراي َ3 مكملDNA الگو بود، همراه با پرايمر مشترك قطعه ما بين دوپرايمر تكثير مي‌گردد و ما در روي ژل دو باند رامشاهده مي‌نمائيم.
اگرپرايمرARMSداراي َ3 مكملDNA الگو نبود، فقط يك باند در روي ژل كه حاصل‌تكثيرمنطقه بين دو پرايمر كنترل مي‌باشد، مشاهده مي‌گردد. زيرا انتهاي َ3ناجور جفت شدگي دارد وباعث جلوگيري از عمل پلي مراز به جهت دور شدن َ3آغازگر ازDNA مي‌شود آقائي(1376) اولين بار در ايران از اين نشانگر براي‌شناسائي جهشهاي ژن كاپاكازئين در گاوهاي بومي‌ايران استفاده نمودند
AFLP
Zabeau و همكاران- 1993روش جديدي را تحت عنوان‌تكثير قطعات برش يافتهِ انتخاب ابداع كردند كه حاصل آنAFLP است. اين روش‌تركيبي ازPCR وRFLPمي‌باشد. درسال1995،Vosو همكاران از اين روش براي انگشت‌نگاري ژنومهائي كه از لحاظ چند شكلي در طول‌قطعات حاصل از هضم، بسيار بهم‌نزديك بودند استفاده نمودند
مزايايAFLP
نياز به پروب‌ندارد
دماي اتصال پرايمر به الگو بسيار بالاست
معمولا غالب است وزماني همبارز است كه سايت برشي پلي مورفيك كاملا داخل قطعه‌باشد
ريزماهواره‌ها
واژه ريزماهوار در سال 1985 بوسيلهJeffery مطرح گرديد و مفهوم آن تواليهاي كوتاه تكرارشونده در ژنوم موجودات مي‌باشد. ريزماهواره‌ها توزيع وسيعي را در اكثر گونه‌هاي مهره‌داران به‌خود اختصاص‌داده‌اند معمولترين تكرارها در ژنوم پستانداران، تكرارهاي دو نوكلئوتيديCA)n و(CT)n وdG - dT)n ) مي‌باشد.
تعداد باز موجود در هر رديف تكرار شونده‌ممكن است دو، سه، چهار يا حتي بيشتر با براي طراحي پرايمر از خود اين‌نوكلئوتيدهاي تكراري استفاده مي‌شود.
كاربرد ميكروساتليتها به عنوان‌آغازگر اولين بار توسط ليكفدت و همكاران بحث شده است چون ميكروساتليتها چندشكلي بالائي دارند مي‌توانند به آساني درPCRرديابي شوند. نقشه‌يابي ژن‌با اين ماركر در گونه‌هائي مانند گاو كه بيش از 400ميكروساتليت شناخته‌شدهدارد، سريعتر صورت خواهد گرفت در حالي كه هر دو الل يك مكان ژني رامي‌توان باRFLPمورد تجزيه قرار داد، در ميكروساتليت‌بندرت مي‌توان تعيين كرديك قطعه خاص در حالت هموزيگوت يا هتروزيگوت بوجود آمده است.
ازميكروساتليت براي كشف اشتباهات موجود در ثبت والدين براي نتاج در مراكزاصلاح نژاداستفاده مي‌شود و در پيش‌بيني ارزشها اصلاحي بكار گرفته مي‌شود. بعضي از مشكلات استفاده ازماهواركها به شرح زير است.
عمليات شناسائي‌ريز ماهواره‌ها، تعيين توالي بازي آنها و طراحي و ساخت آغازگرها
تهيه‌نقشه ژنتيكي بسيار پيچيده بوده و مستلزم صرف وقت و هزينه فوق‌العاده‌است.
به علت پلي‌مورفيسم زيادتر از حد ريز ماهواره‌ها كاربرد آنها فقط‌در رده‌بندي‌هاي درون گونه‌اي پيشنهاد مي‌گردد Lucy و همكاران (1998) از اين‌ماركر براي بررسي پلي‌مورفيسم در ناحيه پيش‌بر(پروموتور) ژن گيرندهِ هورمون‌رشد استفاده نمودند
STS وALP
وجود اختلاف در اندازهِ قطعات‌حاصل ازPCR كه در آن دو پرايمر هدفمند از توالي ژن بكار رفته است راALP گويند. اين اختلاف بيانگر وقوع پديده حذف يا اضافه شدن اين نشانگراست.
دوست عزیز، به سایت علمی نخبگان جوان خوش آمدید
مشاهده این پیام به این معنی است که شما در سایت عضو نیستید، لطفا در صورت تمایل جهت عضویت در سایت علمی نخبگان جوان اینجا کلیک کنید.
توجه داشته باشید، در صورتی که عضو سایت نباشید نمی توانید از تمامی امکانات و خدمات سایت استفاده کنید.
پاسخ با نقل قول
علاقه مندی ها (Bookmarks)