مروری بر ژن درمانی

[Helena.M]

وکتورها
اجزای تشکیل دهنده پلاسمید
وکتورها، پلاسمیدهایی هستند که در مهندسی ژنتیک از آن‌ها استفاده می‌شود. از پلاسمیدها در مهندسی ژنتیک برای تکثیر یا بیان ژن یا ژن‌های خاصی استفاده می‌شود. برای این کار، ژن مورد نظر را وارد پلاسمید می‌کنند. این نوع از پلاسمیدها بطور معمول دارای یک ژن مقاومت آنتی بیوتیکی (برای غربالگری) و یک جایگاه کلونینگ چندگانه (به انگلیسی: multiple cloning site)‏ یا polylinker است. جایگاه کلونینگ چندگانه، قطعه کوچکی از پلاسمید است که دارای چند جایگاه برش برای آنزیم‌های محدودالاثر مختلف (به انگلیسی: restriction enzymes)‏ است. این کار سبب می‌شود که قطعه یا ژن دلخواه به راحتی وارد پلاسمید شود. در مرحله بعد، پلاسمید از طریق ترانسفورماسیون وارد باکتری می‌شود. سپس باکتری در معرض یک آنتی بیوتیک خاص قرار می‌گیرد. باکتری‌هایی که پلاسمید مورد نظر را داشته باشند، زنده می‌مانند زیرا ژن مقاومت آنتی بیوتیکی را بر روی پلاسمید مورد نظر حمل می‌کنند اما باکتری‌هایی که پلاسمید را نداشته باشند، می‌میرند. با استفاده از این روش (غربالگری با آنتی بیوتیک) می‌توان باکتری‌های دارای پلاسمید را جدا ساخت و آن‌ها را به میزان زیاد تکثیر داد. سپس پلاسمیدها را به میزان زیاد از آن‌ها جدا ساخت. ظرفیت پذیرش قطعات DNA در پلاسمیدها بین ۱ تا ۱۰ کیلو جفت باز است. برای کلون کردن قطعات یا ژن‌های بزرگتر بایستی از فاژ لامبدا، کاسمیدها (به انگلیسی: cosmids)‏، کروموزوم‌های مصنوعی باکتریایی (به انگلیسی:bacterial artificial chromosomes)‏ یا کروموزوم‌های مصنوعی مخمری (به انگلیسی: yeast artificial chromosomes)‏ استفاده کرد.
ژن درمانی با استفاده از وکتورهای پلاسمیدی
موفقیت ژن درمانی بستگی به داخل سازی ژن دلخواه به درون کروموزوم انسان بدون ایجاد آسیب به سلول، ایجاد جهش‌های سرطان زا یا پاسخ ایمنی داشته‌است. استفاده از وکتورهای پلاسمیدی، یکی از روش‌های ژن درمانی است. استفاده از نوکلئازهای انگشت روی (Zinc finger nucleases)‏ موجب نوترکیبی هومولوگ در جایگاه خاصی از کروموزوم می‌شود. از این طریق می‌توان ژن دلخواه را وارد سلول‌های انسانی کرد.

اپی زوم‌ها

اپی زوم‌ها معادل یوکاریوتی پلاسمیدهای باکتریایی هستند. در یوکاریوت‌ها بطور معمول اپی زوم‌ها، DNAهای حلقوی بسته‌ای هستند که داخل هسته تکثیر پیدا می‌کنند مانند آدنوویروس‌ها، هرپس ویروس‌ها و پولیوماویروس‌ها. برخی از اپی زوم‌های ویروسی در سیتوپلاسم تکثیر پیدا می‌کنند مانند پوکس ویروس‌ها. برخی از اپی زوم‌ها مانند هرپس ویروس‌ها از مکانیسم دایره غلتان (rolling circle)‏ برای تکثیر خود استفاده می‌کنند مانند آنچه که در مورد فاژهای باکتریایی اتفاق می‌افتد. برخی از آن‌ها از طریق مکانیسم همانند سازی دو جهته (bidirectional replication mechanism)‏ تکثیر پیدا می‌کنند (پلاسمیدهای نوع تتا). در هر دو مورد، اپی زوم‌ها بطور فیزیکی مجزا از کروموزوم میزبان هستند.

انواع مراحل هم یوغی (کانژوگاسیون) در باکتری‌ها
یکی از روش‌های طبقه بندی پلاسمیدها بر اساس انتقال آن‌ها به دیگر باکتری‌هاست. پلاسمیدهای هم یوغی (به انگلیسی: Conjugative plasmids)‏ دارای ژن‌های tra می‌باشند که در فرآیند هم یوغی (کانژوگاسیون) نقش دارد. در هم یوغی، پلاسمید از یک باکتری به باکتری دیگر منتقل می‌شود. پلاسمیدهای غیر هم یوغی توانایی آغاز هم یوغی در باکتری‌ها را ندارند اما می‌توانند با کمک پلاسمیدهای هم یوغی منتقل شوند. انواع مختلفی از پلاسمیدها ممکن است در یک سلول وجود داشته باشد. با این حال، پلاسمیدهای مشابه یا هم خانواده اغلب اوقات ناسازگار (به انگلیسی: incompatible)‏ هستند بطوریکه فقط یکی از آن‌ها در سلول باقی خواهد ماند. این امر به دلیل تنظیم عملکردهای حیاتی آن‌ها اتفاق می‌افتد. پس بنابراین می‌توان پلاسمیدها را در گروه‌های ناسازگاری مختلف طبقه بندی کرد.
روش دیگر طبقه بندی پلاسمیدها بر اساس عملکرد آن هاست:
پلاسمیدهای F یا پلاسمیدهای باروری (به انگلیسی: Fertility)‏ که دارای ژن‌های tra هستند. آن‌ها موجب بیان پیلی جنسی و هم یوغی در باکتری‌ها می‌شوند.
پلاسمیدهای R یا پلاسمیدهای مقاومت که ژن‌های مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک‌ها یا ژن‌های توکسین‌ها (سموم) را حمل می‌کنند.
پلاسمیدهای Col که ژن‌های کد کننده باکتریوسین‌ها را حمل می‌کنند. باکتریوسین‌ها، پروتئین‌هایی هستند که می‌توانند سایر باکتری‌ها را از بین ببرند.
پلاسمیدهای تجزیه کننده (به انگلیسی: Degradative plasmids)‏ که این توانایی را به باکتری می‌دهند تا ترکیبات غیر معمول را تجزیه کنند مانند تولوئن و اسید سالیسیلیک.
پلاسمیدهای بیماریزایی (به انگلیسی: Virulence plasmids)‏ که موجب تبدیل یک باکتری غیر بیماریزا به یک باکتری بیماریزا (پاتوژن) می‌شوند.
تفاوت پلاسمید با کروموزوم
پلاسمیدها، عناصری ژنتیکی هستند که ضرورتی چندانی برای سلول ندارند و تنها برخی ویژگی‌ها را به باکتری‌ها می‌دهند که به بقای آنها کمک می‌کند. در صورتیکه پلاسمیدهای سلول حذف شوند، سلول می‌تواند به زندگی خود ادامه دهد. همچنین همانند سازی پلاسمیدها ارتباطی باچرخه سلولی و تقسیم سلولی ندارد. آن‌ها می‌توانند مستقل از چرخه سلولی به تعداد نامحدود (تعداد را نیاز سلول و شرایط محیطی تعیین می‌کند) تکثیر شوند. در هر سلول ممکن است چندین پلاسمید مشابه وجود داشته باشد. با این وجود، کروموزوم‌ها بسیار برای سلول حیاتی هستند و درصورت حذف هر یک از کروموزوم‌ها، سلول خواهد مرد. تعداد دقیق کروموزوم‌ها، بسیار برای تعادل ژنتیکی سلول ضروری است. حتی اگر یکی از کروموزوم‌های همولوگ حذف شوند، این تعادل بهم خواهد خورد. همانند سازی کروموزوم‌ها دقیقاً منطبق با چرخه سلولی است و در هر چرخه سلولی فقط یک بار همانند سازی می‌کنند.
پلاسمید درمخمردو نوع وکتور مهم پلاسمیدی در مخمرها عبارتند از YIp و YRp.
YIp، پلاسمید الحاقی مخمری (به انگلیسی: Yeast integrative plasmid)‏ است که برای زنده ماندن و تکثیر وارد کروموزوم مخمر می‌شود. YRp، پلاسمید همانندساز مخمری (به انگلیسی: Yeast Replicative plasmid)‏ است که پایداری کمتری دارد و در هنگام جوانه زدن مخمر ممکن است از دست برود.

پلاسمید در گیاهان

پلاسمید Ti، پلاسمیدی از باکتری آگروباکتریوم است که در مهندسی ژنتیک برای تراریخته کردن گیاهان بکار می‌رود
پلاسمید در اثر عفونت با باکتری آگروباکتریوم وارد گیاه می‌شود. امروزه از اینگونه پلاسمیدها، پس از انجام تغییراتی بر روی آنها، برای انجام مهندسی ژنتیک در گیاهان، استفاده می‌شود.

پلاسمید در باکتری‌ها

بیشتر باکتری‌های دارای پلاسمیدهایی می‌باشند که به آنها ویژگی‌های تازه‌ای مانند مقاومت به یک آنتی‌بیوتیک خاص، مصرف نوعی قند یا اسید آمینه، تولید رنگدانه، بیماریزایی، تجزیه هیدروکربن‌ها یا مولکول‌های پیچیده شیمیایی و غیره می‌دهد.

اساس کار

در اغلب موارد مطالعات ژن درمانی، نسخه‌ی صحیح یا نوع وحشی ژن به ژنوم الحاق می‌شود. برای وارد کردن ژن به سلول‌های مورد نظر باید از یک حامل که وکتور نامیده می‌شود استفاده کرد. رایج‌ترین وکتوری که مورد استفاده است ویروس‌ها می‌باشند. ویروسی که به عنوان وکتور استفاده می‌شود به طور ژنتیکی معیوب شده و قادر به بیماری‌زایی نیست اما هنوز قادر است که ژنومش را با DNA سلول میزبان ترکیب کند. سلول‌های مورد نظر با وکتور آلوده می‌شوند و وکتور با الصاق یافتن به ژنوم سلول میزبان محموله‌اش را وارد ژنوم سلول می‌کند.