روش های کشت میکرو ارگانیسم ها

[Dr.vet]

- کشت میکروارگانیسمهای هوازی
- کشت بی هوازی باکتریها
- کشت بی هوازی باکتریها با استفاده از دیسکاتور
- روش شمارش مستقیم
روش کشت پورپلیت را برای شمارش میکروارگانیسمها

در روش پورپلیت با توجه به رقتهای مختلف تهیه شده از نمونه غذایی برای هر رقت 2 تا 4 ظرف پتری اختصاص داده می شود و یک ظرف نیز به عنوان کنترل برای اطمینان از سترون بودن روف پتری و محیط کشت در نظر گرفته می شود. روی ظروف پتری را با شماره نمونه، رقت و تاریخ آزمایش مشخص کرده، در هر دو یا چهار ظرف پتری از رقت مربوط ، یک میلی لیتر قرار می دهند به این ترتیب با استفاده از یک پیپت، کلیه رقتها به ظروف پتری منتقل می شوند، محیط کشت مناسب قبلاً ذوب و در حمام مادی 45 درجه سانتیگراد نگهداری می شود پس از ریختن رقتهای مختلف ماده غذایی به داخل ظروف پتری به هر ظرف حدود 15 میلی لیتر از محیط کشت مذاب که حرارت آن بیشتر از 45 درجه نباشد اضافه می شود . پس از آن بلافاصله در ظرف را بسته، آن را 15 بار از عقب به جلو، 5 بار در جهت عقربه های ساعت، 5 بار از چپ به راست و 5 بار خلاف عقربه های ساعت به آرامی حرکت می دهند تا نمونه و محیط کشت بخوبی مخلوط شوند.
کمی صبر کنید تا محیط کاملاً ببندد و بعد، از میحط مذاب که همچنان در حمام بن ماری نگهداری شده مقدار کمی روی هر ظرف پتری می ریزند به طوری که لایه نازکی از محیط سطح ظرف پتری را بپوشاند. در نتیجه این عمل از آلوده شدن سطحی جلوگیری می شود و همچنین تا اندازه ای شرایط بی هوازی برای نشان دادن حالات تخمیری برخی از باکتریها ایجاد می گردد. پس از بسته شدن لایه دوم ظروف پتری را به طور واژگون در گرمخانه با توجه به حرارت مناسب رشد باکتری مربوط قرار می دهند. کشتها را مدت 24 ساعت در گرمخانه نگهداری می کنند و پس از این مدت به کمک دستگاه پرگنه شمار، پرگنه های ظاهر شده در ظروف پتری را که بین 300 – 30 پرگنه دارند می شمارند. مجدداً 24 ساعت دیگر ظروف را در گرمخانه قرار داده، پس از این مدت یک بار دیگر نیز تعداد پرگنه ها را می شمارند. میانگین تعداد پرگنه های شمارش شده در دو یا چهارظرف پتری با در نظر گرفتن رقت آن تعداد میکروارگانیسمهای موجود در ماده غذایی را تعیین می کند.


روش کشت سطحی را برای شمارش میکروارگانیسمها

در این روش باید ظروف پتری حاوی محیط کشت قبلاً تهیه شده باشند و سطح محیط با قراردادن آنها در گرمخاه 55 -50 درجه سلسیوس به مدت نیم تا دو ساعت خشم شود. در این مدت باید در ظرف پتری باز و سطح محیط رو به پائین باشد. سپس با توجه به رقتهای تهیه شده، برای هر رقت 2 تا 4 ظرف پتری انتخاب نمود و یک ظرف به عنوان کنترل منفی در نظر گرفت . روی هر ظرف پتری را با شماره نمونه رقت و تاریخ کشت مشخص می کنند و پس از تهیه رقتها، از رقیق ترین آنها به کمک پیپت 1/0 میلی لیتری برداشت کرده، در سطح محیط می ریزند و بعد همان پیپت را رقت بعدی که 10 برابر بیشتر است سه بار شسته و 1/0 از آن را برداشته در ظرف پتری مربوط می ریزند. به همین ترتیب ادامه داده می شود تا آخرین رقت، سپس برای هر رقت از یک پخش کننده شیشه ای سترون استفاده کرده، نمونه را بخوبی در سطح ظرف پتری می گسترانند. نحوه حرکت میله شیشه ای یا آنس پلاتین روی سطح محیط کشت باید به گونه ای باشد که از زخمی کردن سطح محیط کشت جلوگیری کند. انجام ای کار با استفاده از میله شیشه ای سترون آسانتر می باشد.سپس ظروف پتری را مانند روش قبل با توجه به انتخاب درجه حرارت و زمان گرمخانه گذاری، مدت 24 ساعت در گرمخانه 1 35 درجه سلسیوس قرار داده، پس از 24 ساعت ظروفی را که بین 300- 30 پرگنه دارند می شمارند. مجدداً ظروف را برای 24 ساعت دیگر گرمخانه گذاری کرده، پس از آن پرگنه ها را شمارش می کنند و میانگین شمارش را بدست می آورند.


روش شمارش باکتریها با کاغذ صافی چه مزایایی دارد و بیشتر در چه مواردی به کار می رود

کاغذهای صافی مخصوص میکروب شناسی در صنعت ساخته شده است که به دلیل داشتن منافذ بسیار ریز، میکروبها را در خود نگه می دارند. از این کاغذ صافیها برای ستون کردن مایعات و محلولهای مختلف حساس به حرارت استفاده می شود. بعضی از کارخانه های سازنده وسایل آزمایشگاهی از این نوع کاغذها با قیفهای مخصوص که در برابر حرارت مقاوم اند و قابل سترون شدن می باشند برای شمارش و جستجوی باکتریها در آب و فرآورده های دارویی ساخته اند و حتی بعضی از سازندگان ظروف پتری مخصوص که قطر آنها متناسب با کاغذهای صافی است و محیط های کشت آماده در آمپولهای کوچک برای یکبار کشت و حتی گرمخانه های کوچک که با برق اتومبیل و یا با باتری کار می کنند برای عملیات صحرایی تهیه و عرضه کرده اند. از این صافیها برای جستجو و شمارش میکروبها در آب آشامیدنی و دیگر آشامیدنیهایی که تعداد باکتریهای آنها کم است و لازم می باشد که حجم زیادی از نمونه برای شمارش و جستجوی باکتری بکار رود استفاده می شود.
از این روش در بهداشت محیط و کنترل آب و فاضلاب و بررسیهای همه گیری شناسی بسیار ارزشمند است.


روش شمارش مستقیم

در روش شمارش مستقیم می توان از لامهای مخصوص نئوبار و یا لام توما که معمولاً برای شمارش گلبولهای خون بکار می رود استفاده نمود. بدین ترتیب که نمونه مورد آزمایش به نسبتهای معین با آب مقطر و یا سرم فیزیولوژی و یا هر رقیق کننده مناسب دیگر، رقیق می شود. بعد از رقت تهیه شده روی لام توما ریخته، یک لامل سنگین روی آ ن قرار می دهند. چند دقیقه صبر کرده، سپس در زیر میکروسکوپ با عدسی 40 میکروارگانیسمها را در حجم معینی شمارش می کنند و با توجه به رقت نمونه – تعداد میکروارگانیسمها در هر گرم و یا سانتیمتر مکعب بدست می آید.

منبع : وبلاگ دامپزشک