مروری بر ژن درمانی

[سونای]

مروری بر ژن درمانی

ژن درمانی (Gene Therapy) بسیاری از صاحب‌نظران از سدة حاضر به‌عنوان سدة مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی مولکولی یاد می‌کنند. به اعتقاد بسیاری از دانشمندان، تولد ژن‌درمانی در اوایل دهه ۱۹۹۰، یک رخداد بزرگ و انقلابی بود که چشم‌انداز جدیدی را در عرصه پزشکی مولکولی ایجاد کرد؛ زیرا برای نخستین بار در تاریخ علوم زیستی، کاربرد روش‌ها و فنون بسیار حساس و جدید جهت انتقال ژن‌های سالم به درون سلول‌های بدن و تصحیح و درمان ژن‌های جهش‌یافته و معیوب، پنجره‌ای نو به سوی مبارزه جدی، اساسی و علّی (نه معلولی و در سطح فرآورده‌های ژنی) با بسیاری از بیماری‌ها گشوده‌است. ژن‌درمانی، در واقع انتقال مواد ژنتیکی به درون سلول‌های یک موجود برای مقاصد درمانی می‌باشد که به روش‌های متفاوت و متنوع (فیزیکی، شیمیایی و زیستی) صورت می‌گیرد.

منبع: مرکز تحقیقات ژنتیک پزشکی

[سونای]

اولین تلاش‌ها در زمینه‌ی ژن درمانی برای درمان یک بیماری بسیار نادر وراثتی به نام بیماری نقص مختلط حاد ایمنی Severe Combined Immuno Difeiciency (SCID) صورت گرفت.

به چند دلیل SCID کاندیدای خوبی برای درمان از طریق ژن درمانی بود:

-1 برای این بیماری درمانی وجود نداشت.

2-SCID نتیجه‌ی تغییر ژن خاصی است که از پیش ایزوله و کلون شده بود بنابراین برای استفاده در ژن درمانی فراهم بود.

3- سلول‌هایی که هدف درمان‌اند، لنفوسیت‌ها، به راحتی قابل استخراج و کشت در محیط آزمایشگاه بودند و همچنین بعد از اصلاح ژنتیکی، آن‌ها را می‌توان مجدداً به جریان خون بازگرداند.







علیرغم اینکه در حال حاضر ژن‌درمانی، روشی پرهزینه بوده و به فنون پیشرفته و تخصصی نیاز دارد، اما به‌زودی از این روش در مورد طیف بسیار وسیعی از بیماری‌ها استفاده خواهد شد. همچنین شواهد فزآینده و امیدبخشی وجود دارد که استفاده از روش‌های پزشکی مولکولی، در آینده‌ای نه چندان دور و در مقایسه با وضع کنونی، صدها بار هزینه‌های درمانی را نیز کاهش خواهد داد.

تعدادی از بیماریهای مهم انسان در اثر ناتوانی بدن در ساختن پروتئین بخصوصی ایجاد می‌شود که معمولاً در بافت یا عضو خاص یا در مایعات بدن مانند خون اتفاق می‌افتد و این امر می‌تواند سبب بیماری شدیدی شود که در تمام طول عمر شخص همراه او خواهدبود. بسیاری از بیماریهای ژنتیک از این جمله است مانند: آنمی سیکل سل، هموفیلی، دیسترفی عضلانی دوشن (‏DMD‏)، تالاسمی و غیره.


اولین وعدة زیست فناوری (بیوتکنولوژی) جداکردن و تولید این پروتئینها از طریق مهندسی ژنتیک و فناوری نوترکیبی بود تا آنها را در اختیار بیمارانی قراردهد که فاقد آن پروتئینها بود.

حال اگر این پروتئینها به‌صورت داروهای خوراکی استفاده می‌شد هضم شده و بی اثر می‌گشت. برخی از محصولات به‌ وسیله تزریق به بدن می‌رسید، تزریقهای مکرری که روزانه، هفتگی یا ماهیانه یا توسط خود بیمار انجام می‌شد(مثل انسولین) یا توسط پزشک. اما این کارهم خالی از اشکال نبود، زیرا بسیار سخت است که سطح مناسبی از دارو( پروتئین ) را در فواصل بین تزریقها برقرارکرد. از طرفی برخی سلولها نظیر سلولهای مغزی به علت وجود سد خونی مغزی ( ‏BBB‏ ) ممکن است نتوانند مقدار مناسبی از دارو را دریافت کند.


با ظهور ژن درمانی امیدهای تازه ای برای این بیماران فراهم شده است. ژن درمانی تحویل خودِ پروتئینِ درمانی نیست بلکه ژن آن پروتئین را تحویل بیمار می‌دهد. این ژن وارد سلولهای بدن شده و آنها را به کارخانه‌های کوچکی تبدیل می‌کند که پروتئین موردنیاز بیمار را تا مدتی طولانی برایش می‌سازد.


کشف بسیاری از ژن‌های بیماری‌زای مهم در آینده نزدیک، کاربرد روش‌های متنوع و بی‌سابقه غربال‌سازی ژنتیکی و پیشگویی‌های بسیار دقیق پیرامون تعیین سرنوشت جنین از نظر بیماری‌های ژنتیک پیش و پس از تولد، از دیگر قابلیت‌های مهندسی ژنتیک و ژن‌درمانی است. پژوهشگران با انجام تحقیقات گسترده بر بسیاری از محدودیت‌های موجود در زمینه ژن‌درمانی فائق آمده‌اند. همچنین در زمینه هدف‌گیری بسیار اختصاصی سلول و انتقال ژن یا DNAی برهنه به درون آن- به عنوان دارو- پیشرفت‌های چشمگیری حاصل شده‌است.

[سونای]

وارد کردن یک ژن به داخل سلولهای پیکری ممکن است به 3 منظور لازم باشد


• ژن درمانی قادر به جبران کردن یک ژن جهش یافته سلولی که نوعی جهش از دست دهنده عملکرد دارد، بکار برود. مثلا برای درمان بیماری مغلوب اتوزومی فنیل کتونوریا.

• ژن درمانی را برای جایگزینی یا غیر فعال کردن یک ژن جهش یافته غالب که فرآورده غیر طبیعی آن موجب بیماری می‌شود انجام داد مانند بیماری هانتیگتون.

• گسترده‌ترین کاربرد احتمالی ژن درمانی در رسیدن به اثری فارماکولوژیک ، جهت مقابله با آثار یک ژن یا ژنهای جهش یافته سلولی یا مقابله با ایجاد بیماری به طریق دیگر باشد.

مبتلایان به بیماری اکتسابی از جمله سرطان ، از این روش بهره می‌برند


احتمالا ژن درمانی برای هر کسی مناسب نخواهد بود؛ و مطالعات کاملتری لازم است تا بدانیم چه کسانی بیشترین منفعت را از ژن درمانی میبرند. احتمالا بیماران پارکینسونی که در مراحل اول بیماری قرار دارند و هنوز سلولهای عصبی تولید کننده دوپامین زیاد تخریب نشده اند، و نیز آنهایی که علائمشان بخوبی با داروهای موجود کنترل نشده است و یا با داروهای فعلی دچار عوارض شدیدی نظیر حرکات غیر ارادی یا دیسکینزی (Dyskinesia) می شوند کاندیدهای بهتری برای ژن درمانی خواهند بود.ژن درمانی احتمالا در افراد دچار افسردگی شدید، زوال شدید ذهنی و جنون یا سایکوز (Psychosis) روش مناسبی نخواهد بود. گذشته از اینکه عامل بیماری پارکینسون ژنتیک باشد یا نه، بیماران ممکن است از ژن درمانی سود ببرند.




حداقل شرایط لازم برای ژن درمانی اختلال ژنتیکی

1. شناسایی جایگاه ژنی درگیر یا حداقل اساس بیوشیمیایی آن اختلال.

2. بار قابل توجه تبادل توجه بیماری و نسبت مطلوب خطر.

3. داشتن فایده در مقایسه با درمانهای دیگر.

4. آگاهی کافی از اساس مولکولی بیماری.

5. اجزای تنظیم کننده مناسب برای ژن انتقال یافته.

6. یک سلول هدف مناسب با نیمه عمر ترجیحا طولانی یا قابلیت همانند سازی خوب در داخل بدن.

7. اطلاعات کافی از مطالعات سلولهای کشت داده شده.





خصوصیات ژن انتقال یافته

یک ژن انتقال یافته اکثرا از یک DNA مکمل تحت کنترل توالی پیشبری که ممکن است، لزوما پیشبر طبیعی ژن نباشد تشکیل شده است. عناصر تنظیم کننده باید طوری انتخاب شوند که ژن در سطوح کافی در سلولهای هدف رونویسی شود و در صورت لزوم به پیامهای تنظیم کننده ضروری پاسخ دهد.




خصوصیات سلول هدف

یکی از ملاحظات مهم در انتخاب سلول هدف مناسب این است که نیمه عمر طولانی در بدن یا قابلیت همانند سازی چشمگیر داشته باشد تا اثر زیستی انتقال ژن واجد دوام لازم باشد. سلولهای هدف ایده‌آل ، سلولهای بنیادی یا سلولهای اجدادی با قابلیت همانند سازی بالا می‌شوند که از آنها می‌توان به سلولهای بنیادی مغز استخوان اشاره کرد. همچنین سلولهای آندوتلیال ممکن است اهداف بویژه مفیدی برای انتقال ژن باشند. زیرا دیواره‌های عروق خونی را مفروش می‌کنند. سلول هدف باید پروتئینها یا لیگاندهای دیگر لازم برای فعالیت زیستی را نیز فراهم کند.

[سونای]

روشهای انتقال ژن

1. روش اول

وارد کردن ژن به داخل سلولهای کشت داده شده از بیمار در خارج بدن و سپس وارد کردن سلولها به بدن بیمار پس از انتقال ژن است.

2. روش دوم
روش دوم ، تزریق کردن مستقیم ژن به داخل بافت یا مایع خارج سلولی مورد نظر از طریق ناقلهای ویروسی و ناقلهای غیر ویروسی است. فناوری ناقلهای غیر ویروسی ، هنوز در مراحل مقدماتی است.


الف) ناقلهای ویروسی

ناقل ایده‌آل برای ژن درمانی باید بی‌خطر باشد، به راحتی ساخته شود، به آسانی وارد بافت هدف گردد، بروز مادام‌العمر ژن مورد نظر در سطوح مناسب را فراهم کند. از انواع این ناقلها می‌توان به رترو ویروسها و آدنوویروسهااشاره کرد. از مزایای ناقلهای ویروسی این است که قادرند وارد هر سلولی در جمعیت هدف شوند.

ب )ناقلهای غیر ویروسی

اساسا جذاب هستند، زیرا فاقد مخاطرات زیستی (مانند آلودگی) مربوط به ناقلهای ویروسی هستند و تهیه آنها از نظر تئوری راحت‌تر است. این ناقلها 4 دسته هستند.

dna- برهنه ، مثلا dna مکمل با عناصر تنظیم کننده در پلاسمید.
Dna- برهنه ، بسته بندی شده در لیپوزمها.
-پروتئین که در آن dna با پروتئینی مجموعه تشکیل می‌دهد و این پروتئین ورود مجموعه به داخل سلول یا بخشهای اجزای سلولی را تسهیل می‌کند.
-کروموزومهای مصنوعی.

[سونای]

مخاطرات ژن درمانی

1-بیمار می‌تواند واکنش نامطلوبی به ناقل یا ژن انتقال یافته بدهد.
2-ژن انتقال یافته در dna بیمار جای می‌گیرند و پروتوانکوژنی را فعال یا یک ژن سرکوب کننده تومور را غیر فعال می‌کند که موجب بدخیمی می‌شود.
3-فعال شدن درجی می‌تواند انسجام یک ژن ضروری را از بین ببرند.

بیماریهای نامزد ژن درمانی

تعداد زیادی از اختلالات تک ژنی ، نامزدهای بالقوه برای اصلاح از طریق ژن درمانی هستند. اینهاشامل اختلالات خون سازی مانند تالاسمی ، هموفیلی ، انواع گوناگون کمبود ایمنی و نیز اختلالاتی مانند فنیل کتونوریا ، کمبود α1- at که هر یک بر پروتئینهایی که در کبد ساخته می‌شوند، موثر هستند.

هدف ازژن تراپی:

1-شناخت اهمیت و استفاده / سوء استفاده از ژن درمانی است.
2-تعریف در زمینه تئوری و روش های آن.
3-پرداختن به کاربردهای بالقوه بالینی، محدودیت ها، و جهت گیری های آینده.

کاربرد ژن درمانی:

الف. مدیریت و اصلاح بیماری های انسان بصورت اختلالات ارثی ویا اکتسابی
ب. سرطان
ج. Aids / hiv
امید پیشرفت در طی دو دهه اخیر در تکنولوژی dna نوترکیب است.
1. موفقیت های اخیر در درمانscid.
(تا همین اواخر) اثر بخشی در هر پروتکل ژن درمانی قطعی نیست.زیرا
1. کاستی ها در وکتورهای انتقال ژن.
2. درک ناکافی از فعل و انفعالات بیولوژیکی وکتور و میزبان.

[سونای]

وکتورهای برای انتقال ژن:

Retroviruses: نامزدها مناسب اند و به طور گسترده ای استفاده می شود.
دارای دامنه گسترده مانند سلولهای مغز استخوان ،فیبروبلاست ،عضلانی ...

معایب : گنجایش محدود ژن 8-9 kb
- قرار دادن مواد ژنتیکی به DNA میزبان است.
- وارد کردن ممکن است یک ژن میزبان را مختل کند.
- وارد کردن ممکن است در منطقه ای که تولید نمی کند
بسیار زیادی از پروتئین مورد نظر
- می تواند پاسخ ایمنی را آغاز کند.
هرپس ویروس : DNA دورشته برای عفونت های سیستم عصبی بکار میروئد.
ژن وارد شده در روی کروموزوم 19 قرار می گیرد

ویژگی های ایده آل وکتور:

1.درج کلی: یک یا چند ژن.( وارد شدن کامل ژن )

2.هدف: محدود به یک نوع سلول است.( در سلول هدف ژن عمل کند )
3.پاسخ ایمنی وجود ندارد.
4.پایدار: جهش نیست.
5.تولید: آسان تولید به تولید غلظت بالا (تیتر).
6. Regulatable: تولید پروتئین به اندازه کافی به باعث یک اثر.
وکتورهای رترویروسی بسته بندی می شود برای ژن تراپی بسته بندی ویرال های(بیان ژنهای ) gagوpol که تولید می کند تیتر بالای از
ویروس نوترکیب بعد از 24-72 ساعت.
ناقل های غیر ویروسی DNA Lلیپوزوم ، DNA برهنه ،نانوذرات
لیپوزومهای کاتیونی: بار مثبت چربی واکنش می دهد با بار منفی DNA . (چربی کمپلکس- DNA).
غشای سلولی، Transverses
مزایا:
الف. مجموعه پایدار
ب. می تواند DNA بزرگ حمل
ج. می تواند سلول های خاص را هدف قراردهد
د. واکنش های ایمنی را القا نمی کند.
معایب:
الف. کارایی ترانسفکشن پایین
ب. بیان گذرا (موقتی )
ج. مهارمی شود با سرم
د. دربرخی از سلولها سمیت ایجاد می کنند

[سونای]

ژن درمانی برای خاموش کردن ژن:

antisense به روش:
* DNA ،mRNA مربوط را می سازد،بعد mRNA به پروتئین می سازد.
آنتیسنس مکمل mRNA ژن (sense) وجلوگیری از بیان پروتئین است.
*مولکولهای RNAکوچک تداخل گر(siRNA ).RNAa

درمان خاموش: siRNA ها به عنوان داروهای مولکول کوچک است.
* Ribozymes
 دسته بندی پروتکل های انتقال ژن بالینی.
1. ارثی / بیماری های تک ژنی:
ADA کمبودآلفا-1 antitrypsin هستند
بیماری گرانولوماتوز مزمن
فیبروز کیستیک
کلسترولمی خانوادگی
Fanconi کم خونی
بیماری گوشه
Hunter سندرم
Parkinsons
2. بیماری های عفونی:HIV
3. اختلالات اکتسابی :بیماری عروق وقلبی-آرتریت روماتوئید
4.سرطان (مرتبط به آن):آنتیسنسChemoprotection



ایمونوتراپی: در شرایط ازمایشگاهی / در داخل بدنThymidylate کیناز
سرکوبگر تومور ژن

[سونای]

انواع روش‌هاي ژن درماني به صورت زير است:

* ژن درماني در رده سلول‌هاي زاينده :در اين روش ژن‌ها در سطح تخمك يا اسپرم اصلاح مي‌شوند.
* ژن درماني در رده سلول‌هاي سوماتيك :در اين شيوه ژن‌ها در سطح سلول‌هاي غير جنسي و بافتي اصلاح مي‌شوند.
* ژن درماني در مرحله جنيني :ژن درماني در مرحله جنيني مطالعه اثر ژن‌هاي فعال در مراحل جنيني مختلف براي درمان بيماري‌هاست.
تحقيقات بسياري درباره امكان درمان بيماري‌هايي نظير ايدز و بيماري‌هاي سرطاني به روش ژن‌درماني انجام شده است. محققان موفق شده‌اند با استفاده از ژن‌درماني در سلول‌هاي بنيادي انسان و حذف ژن كد‌كننده گيرنده ويروس ايدز از ژنوم سلول‌هاي ايمني حاصل از تمايز اين سلول‌ها راه ورود اين ويروس را به بدن سد كنند. در اين نمونه محققان از ژن‌درماني براي بالابردن توان سيستم ايمني بدن و مقابله با ويروس ايدز استفاده كرده‌اند

[سونای]

استفاده از نانوذرات براي ژن‌درماني
محققان توانسته اند بااستفاده از نانوذرات براي ژن‌درماني، از رشد تومورهاي تخمدان در موش جلوگيري كنند.
اين نانوذرات كه از پليمرهاي زيست‌تخريب‌پذير ساخته شده‌اند، مي‌توانند به يكي از بزرگ‌ترين موانع ژن‌درماني غلبه كنند:ويروس‌هايي كه براي انتقال ژن به درون بدن استفاده مي‌شوند، غالباً مي‌توانند براي بيمار خطرناك باشند. به علاوه كارايي اين نانوذرات در انتقال ژن كمتر از كارايي ويروس‌ها نيست.
پليمر زيست‌تخريب‌پذير به نام پلي بتا-آمينو استر توليد كرد.
زماني كه اين پليمرهاي سنتزي با DNA مخلوط مي‌شوند، به طور خود به خودي به شكل نانوذرات درمي‌آيند. كمپلكس پليمر- DNA زماني كه درون يا نزديك بافت هدف تزريق شوند، همانند يك ويروس مصنوعي عمل كرده و DNA را رها مي‌كنند.


گلیبرا یک وکتور مربوط به آدنوویروس است که به گونه ای دستکاری شده است که بتواند آنزیم لیپو پروتئین لیپاز را در افراد مبتلا به این نقص نادر آنزیمی بیان نماید. تائیدیه این دارو توسط اتحادیه اروپا یک خبر خوب برای علوم سلولی و مولکولی با رویکرد درمانی است. اگرچه تنظیم بیان این پروتئین در سلول مشکلات زیادی خواهد داشت ولی امیدواری برای چنین فعالیت هایی برای جامعه زیست شناسی افزایش خواهد یافت.

در روش استفاده از ویروسِ ‏AAV‏ ، ژنهای ویروس از یک ویروس بی خطر به نام “‏AAV‏ ویروس” خارج شده و سپس ژنِ درمان کننده به‌جای آن جایگزین می‌شود. بعد از تزریق این ویروسها به بیمار “‏AAV‏ ویروس ها” می‌تواند ژنِ درمان کننده را به سلولها انتقال دهد. حال پروتئین موردنیاز توسط سلولهای خودِ بیمار ساخته خواهد شد، همان‌گونه که اگر خود سلول ‏ DNA ‏ مربوطه را می‌داشت عمل می‌کرد. این پروتئین یا وارد غشاء سلول می‌شود تا مورد استفادة خود سلول قرارگیرد یا توسط سلول ترشح می‌شود که مورد استفادة سلولهای دیگر قرارگیرد.

● ویروس ‏AAV‏ (‏Adeno-Associated Virus‏)‏
‏”‏AAV‏ ویروس” یک ویروس خیلی ساده از شاخه های خانوادة ‏parvoviridae‏ است و جزء ویروسهای بدون پوشش وکوچک است. “‏AAV‏ ویروس” نامش را به این علت گرفته است که در ۴۰ سال پیش آن را در جریان آلودگی یک نمونة بالینی مبتلا به آدنوویروس کشف کردند. بدین ترتیب نام ‏Adeno-Associated Virus‏ به آن اطلاق شد. به هر حال “‏AAV‏ ویروس” در هیچ یک از خواص ویروسی با آدنوویروسها مشترک نیست و در حقیقت ژنهایشان (‏DNA ‏) با هم هیچ شباهتی ندارد و این موضوع مهم است چرا که بر خلاف آدنوویروسها، “‏AAV‏ ویروس” در انسان پاتوژن نیست.

● وکتورهای ‏AAV‏ ‏
وکتورهای ‏AAV‏ مشتق از ویروسِ ‏AAV‏ که از عملکرد طبیعی خودشان استفاده کرده و ژنها را به سلول تحویل می‌دهد. جهت تولید یک وکتور ‏AAV‏ ، ویروس ‏AAV‏ را با خارج کردن ژن ویروسی و جایگزین کردن آن با ژن درمان کننده (برای تولید پروتئین مربوط) تغییر می‌دهند.

‏ DNA ‏ متعلق به “‏AAV‏ ویروس” تک رشته‌ای است و فقط شامل ۲ ژن است. یکی به نام ژن ‏Rep‏ که پروتئینهای مربوط به همانندسازی ‏DNA‏ را کد می‌کند و دیگری به نام ژن ‏Cap‏ که از اسپلایسینگ افتراقی استفاده می‌کند و اجازه می‌دهد که سه پروتئین را کد کند که پروتئینهای پوشش(‏coat‏) ویروس را می‌سازد.

با استفاده از این روش در حالی که هیچ‌‏‎ ‎کدام از ژنهای ویروسی وجود ندارد اتصال سلولی کارا و ساز و کار ورود ژن بوسیلة پروتئین پوششی “‏AAV‏ ویروس” مهیا می‌شود. فقط قسمتی کوچکی از ‏ DNA ‏ متعلق به ‏AAV‏ در طرفین این قطعة ژنی درمان کننده در وکتور باقی می‌ماند که حاوی قطعات خودکامل شونده ‏DNA‏ ملقب به ‏ITR‏ ها (‏Inverted Terminal Repeats‏ ) است و این ژنها برای تامین سطح بالایی از بیانِ ژنِ درمان کننده‌ای که وکتور آن را حمل می‌کند، لازم است.‏

هر وکتور ‏AAV‏ فقط از ۴ نوع مولکول تشکیل شده است. سه وکتور، دقیقاً در ارتباط با پروتئین‌هایی است که پوشش ویروس را می‌سازد و یک قطعة تک رشته ای ‏ DNA ‏ ژن درمان کننده و دیگر عناصر تنظیم کننده را کد می‌کند.

سادگی این سیستم باعث می‌شود که گیرندگان وکتورهای ‏AAV‏ در معرض حداقل مقدار مواد خارجی (بیگانه) قرار گیرند. در مقابل دیگر وکتورهای ویروسی که برای ژن تراپی استفاده می‌شود، مانند آنهایی که با استفاده از آدنو ویروس‌ها، لنتی ویروس‌ها، رترو ویروسها، و هرپس ویروس‌ها درست شده‌اند، به‌طور بارزی بزرگتر و پیچیده‌تر است و بنابراین احتمال آن که به پاسخ ایمنی منجر شده و واکنش‌های زیان آوری را برای استفاده های بعدی درپی داشته باشد، بسیار بیشتر است.

عقیده بر این است که وکتورهای ‏AAV‏ خواص مطلوب وکتورهای ویروسی و وکتورهای غیر ویروسی را ترکیب می‌کند و ممکن است نسبت به دیگر وکتورهای ژن درمانی چندین مزیت بالقوة ارائه دهد. این مزایا عبارتند از:
▪ تحویل موثر ژن‏‌ها به هر دو نوع سلول هدف در حال تقسیم و آنهایی که تقسیم نمی شود،
▪ عدم حضور ژنهای ویروسی که می‌تواند مسؤول ایجاد پاسخ ایمنی ناخواسته باشد،
▪ کاربرد ‏in-vivo‏ در بیماران،
▪ میزان بالای بیان ژن
▪ پایداری عالی که اجازه می‌دهد وکتورهای ‏AAV‏ همانند بیشتر محصولات دارویی رایج تولید و ذخیره شده و مورد استفاده قرار گیرد. ‏

برای انتقال مواد ژنتیک بداخل مغز بیماران پارکینسونی، محققان از برخی ویروسها نظیر آدنوویروس یا لنتی ویروس استفاده می کنند. قبل از اینکه از این ویروسها بعنوان ناقل ژن استفاده شود بایستی قابلیت بیماریزایی آنها را متوقف کرد. ژنهایی که مواد درمانی ( نظیرGDNF و یا پروتئین هایی که دوپامین تولید می کنند) را کد می کنند را می توان وارد این ویروسها کرد؛ سپس این ویروسها مستقیما به قسمت مورد نظر در مغز فرستاده می شوند تا یا از تخریب بیشتر سلولهای سازنده دوپامین جلوگیری کنند و یا این سلولها را برای تولید دوپامین تحریک کنند. محققان ساختار این ویروسها را طوری تغییر داده اند که نتوانند به قسمتهای دیگر بدن انتشار یابند.

[سونای]

پلاسمید وکتوری مناسب برای ژن درمانی

تصویر یک باکتری و پلاسمید در داخل آن.

پلاسمید (به انگلیسی: plasmid)‏، مولکول DNA کوچکی است که بطور مجزا از کروموزوم در سلول وجود دارد. همانند سازی پلاسمیدها درسیتوپلاسم و بطورمستقل از ژنوفور انجام می‌گیرد. پلاسمیدها معمولاً به شکل یک مولکول DNA دورشته‌ای حلقوی هستند (هرچند انواع خطی پلاسمید نیز وجود دارد). هر پلاسمید دارای یک محل آغاز همانند سازی (ori) است که همانند سازی پلاسمید از آن نقطه شروع می‌شود.

پلاسمیدها در باکتری‌ها، آرکئا (آرکی باکترها)، مخمر و گیاهان بطور طبیعی دیده می‌شوند اما می‌توان آنها را به شکل مصنوعی (ترانسفورماسیون) وارد سلول‌های جانوری نیز نمود. در طبیعت، پلاسمیدها می‌توانند موجب بهتر زنده ماندن ارگانیسم‌ها شوند بطور مثال آن‌ها می‌توانند حامل ژن‌های مقاومت آنتی بیوتیکی باشند. پلاسمیدها از طریق انتقال افقی ژن‌ها(به انگلیسی: horizontal gene transfer)‏ از یک باکتری به باکتری دیگر انتقال پیدا می‌کنند. پلاسمیدها معمولاً به شکل یک مولکول DNA دورشته‌ای حلقوی هستند (هرچند انواع خطی پلاسمید نیز وجود دارد).

اندازه پلاسمیدها از ۱ تا ۱۰۰۰ کیلوجفت باز متغیر است. از یک تا هزاران پلاسمید می‌تواند در یک سلول وجود داشته باشد. پلاسمیدها بیشتر اوقات از طریق کانژوگاسیون (یکی از مکانیسم‌های انتقال افقی ژن‌ها) از یک ارگانیسم به ارگانیسم دیگر منتقل می‌شوند.

واژه پلاسمید، اولین بار توسط زیست شناس امریکایی جوشوآ لدربرگ (به انگلیسی: Joshua Lederberg)‏ در سال ۱۹۵۲ بکار گرفته شد.

وکتورها

اجزای تشکیل دهنده پلاسمید

وکتورها، پلاسمیدهایی هستند که در مهندسی ژنتیک از آن‌ها استفاده می‌شود. از پلاسمیدها در مهندسی ژنتیک برای تکثیر یا بیان ژن یا ژن‌های خاصی استفاده می‌شود. برای این کار، ژن مورد نظر را وارد پلاسمید می‌کنند. این نوع از پلاسمیدها بطور معمول دارای یک ژن مقاومت آنتی بیوتیکی (برای غربالگری) و یک جایگاه کلونینگ چندگانه (به انگلیسی: multiple cloning site)‏ یا polylinker است. جایگاه کلونینگ چندگانه، قطعه کوچکی از پلاسمید است که دارای چند جایگاه برش برای آنزیم‌های محدودالاثر مختلف (به انگلیسی: restriction enzymes)‏ است. این کار سبب می‌شود که قطعه یا ژن دلخواه به راحتی وارد پلاسمید شود. در مرحله بعد، پلاسمید از طریق ترانسفورماسیون وارد باکتری می‌شود. سپس باکتری در معرض یک آنتی بیوتیک خاص قرار می‌گیرد. باکتری‌هایی که پلاسمید مورد نظر را داشته باشند، زنده می‌مانند زیرا ژن مقاومت آنتی بیوتیکی را بر روی پلاسمید مورد نظر حمل می‌کنند اما باکتری‌هایی که پلاسمید را نداشته باشند، می‌میرند. با استفاده از این روش (غربالگری با آنتی بیوتیک) می‌توان باکتری‌های دارای پلاسمید را جدا ساخت و آن‌ها را به میزان زیاد تکثیر داد. سپس پلاسمیدها را به میزان زیاد از آن‌ها جدا ساخت. ظرفیت پذیرش قطعات DNA در پلاسمیدها بین ۱ تا ۱۰ کیلو جفت باز است. برای کلون کردن قطعات یا ژن‌های بزرگتر بایستی از فاژ لامبدا، کاسمیدها (به انگلیسی: cosmids)‏، کروموزوم‌های مصنوعی باکتریایی (به انگلیسی:bacterial artificial chromosomes)‏ یا کروموزوم‌های مصنوعی مخمری (به انگلیسی: yeast artificial chromosomes)‏ استفاده کرد.


ژن درمانی با استفاده از وکتورهای پلاسمیدی

موفقیت ژن درمانی بستگی به داخل سازی ژن دلخواه به درون کروموزوم انسان بدون ایجاد آسیب به سلول، ایجاد جهش‌های سرطان زا یا پاسخ ایمنی داشته‌است. استفاده از وکتورهای پلاسمیدی، یکی از روش‌های ژن درمانی است. استفاده از نوکلئازهای انگشت روی (Zinc finger nucleases)‏ موجب نوترکیبی هومولوگ در جایگاه خاصی از کروموزوم می‌شود. از این طریق می‌توان ژن دلخواه را وارد سلول‌های انسانی کرد.