مقایسه روشهای مختلف استخراج dna برای ژنوتایپینگ دامها با نشانگرهای pcr-rapd و pcr-rflp

مقایسه روشهای مختلف استخراج DNA برای ژنوتایپینگ دامها با نشانگرهای PCR-RAPD و PCR-RFLP

چكیده:
امروزه برای شناسائی جهشهای موجود در سطح ژنوم پستانداران می توان از تكنیكهای مختلفی همچون روشهای مبتی بر PCR از جمله Microsatellite، SSCP، AFLP، RFLP، DGGE و ARMS استفاده نمود. این تكنیكها عمدتا برای نقشه یابی ژنها، تشخیص ژنوتیپهای مختلف یك ژن مطلوب و همچینین مطالعات جمعیتی و آزمون انساب استفاده می شود. مزیت انكارناپذیر این تكنیكها، تجریه و تحلیل سریع اطلاعات ژنوم در یك جمعیت با استفاده از مقادیر بسیار ناچیزی از DNA می باشد. بنابراین در قدم اول نیاز به استفاده از یك روش استخراج DNA كه سریع و بی خطر و مقرون به صرفه باشد، همواره احساس می شود. چندین روش مختلف به منظور حداقل كردن مراحل استخراج DNA ، توسط محققان مختلف گزارش شده است. در این تحقیق اقدام به مقایسه روشهای مختلف استخراج DNA از خون، شیر، ریشه مو، اسپرم گردید. كیفیت و كمیت استخراج با دو روش اسپكتوفتومتری و ژل مونتیورینگ مشخص شد. و در نهایت برای ارزیابی كیفیت DNA استخراج شده ، انجام تكنیكهای (RAPD) با استفاده از آغازگر تصادفیOPU13 و RFLP با استفاده از آغازگرهای اختصاصی 24 جفت بازی طراحی شده برای تكثیر 422 جفت باز از اینترون دو ژن لپتین و با استفاده ازآنزیم برشی Sau3AI، صورت پذیرفت. در نهایت روش سیلیكا ژل روشی منلسب، مقرون صرفه برای استخراجDNA برای سلولهای مختلف پیشنهاد می گردد.


مقدمه:
نقطهِ شروع بسیاری از روشهای بیولوژی مولكولی ، ضرورت جداسازیDNAبا كیفیت عالی است. معمولا كیفیتDNA با عواملی از قبیل عدم آلودگی ناشی ازRNA، پروتئین، لیپید و سایرساختارهائی كه برای آنزیمهای برشی و پلی مرازها مزاحمت ایجاد می كنند سنجیده می شود.(1و4) به علت بزرگ بودن اندازهِ DNA ژنومی در پستانداران، روشهای استخراج DNA باید حداقل استرس مكانیكی را در طی استخراج ایجاد نمایند. معمولإ روشهائی كه در آنها چندین شوینده همچونSDS و‏TritonX100 استفاده می شود،كه نقش آنها لیز نمودن سلول و كمك به از بین بردن پروتئین متصل بهDNA می باشد. پروتئین زدائی بیشتر از طریق پروتیئنازK صورت می گیرد كه این ماده در بافر لیز كننده مورد استفاده قرار می گیرد(4). این آنزیم در حضورSDS در دمایc 56-65فعالیت دارد تحت این شرایط پروتئین بهتر واسرشت می شود برعكس در همین شرایط آنزیمهای دیگر مثلDNAase دناتوره می شود. متعاقب استفاده از پروتیئنازK از ایزوپروپانول برای از بین بردن موِثر پروتئین ها استفاده می شود و باقیمانده پروتئین و لیپید نیز بطور موِثر از طریق كا ربرد فنل و كلروفورم از بین می رودآلودگیRNA از طریق تیمار كردن نمونه با RNAase از بین می رود. در روشهای دیگر بعد از پروتئینازK از نمك اشباع برای رفع آلودگی پروتئین استفاده می شود در استخراجDNA از هپارین برایPCR بهتر است استفاده نشود چون هپارین از فعالیتTaq پلی مراز جلوگیری می كند . وجودEDTA حداقلmM 2در بافر استخراج باعث می شود كه كوانزیمهای آنزیمAase DN با EDTA شلات شود و از تجزیه تصادفیDNA جلوگیری نماید(1و4و5)
. دستورالعمل استخراجDNA با پشتوانه ای از دانش بیوشیمی همراه است و نباید صرفا استفاده از چند ماده انگاشته شود، درك عملكرد هر ماده این امكان را فراهم خواهد نمود كه درصورت نبود یك ماده از ماده دیگری با كار مشابه استفاده كرد. در این تحقیق از روشهای استخراج DNA استفاده گردید كه در زیر به جزئیات آنها اشاره می شود.
مواد و روشها
نمونه های خون اسپرم ، شیر ، ریشه مو از گاوهای بومی وگاومیش جمع آوری گردید. خونگیری در گاوهای بزرگ از ورید دمی ودر گوساله ها از وریدوداج صورت گرفت. سپس نمونه ها از مزرعه داخل لوله های حاوی خلا و EDTA همراه با یخ به آزمایشگاه اصلاح نباتات مولكولی دانشگاه تبریز گردید و تا زمان استخراج در 20 درجه سانتیگراد نگهداری گردید.
تخلیص DNA
در این تحقیق، تخلیصDNA برروی اسپرم ، گلبولهای سفید خون ، شیر و ریشه مو انجام پذیرفت .

روش جوشاندن
ابتدا 5/0 سی سی خون در تیوبهای 5/1 میلی لیتر كه فاقد هرگونه آلودگی می باشد ریخته و به میزان یك میلی لیتر بافر R(mM10 تریس 5/7 =pH ،mM 33/0 ساكاروز ،mM 10 كلرید منیزیم و1% تریتون 100X ) اضافه و خوب آن را مخلوط و به مدت دو دقیقه با سرعت g1000 سانتریفوژ می كنیم سپس محلول روئی دور ریخته و مراحل را آنقدر ادامه می دهیم تا رسوب سفید رنگ شود. سپس 100 میكرولیتر محلول (mM 50 هیدروكسید سدیم ) اضافه و به مدت 20 دقیقه در آب حوش قرار داده می شود ، تا گلبولهای سفید لیز شوند بعد از آن 20 میكرولیتر محلول (mM 1بازتریس 5/7 = pH ) اضافه و بعد از سانتریفوژ كردن به مدت 30 ثانیه در g1000 محلول روئی را در تیوب جدید منتقل وتا زمان انجام آزمایشها در 20 – درجه سانتیگراد نگهداری می شود(3).
تخلیص DNA به روش Salting out
ابتدا گلبولهای قرمز توسط بافر R لیز شده و گلبولهای سفید رسوب داده می شود. سپس 300 میكرو لیتر بافر هضم كننده(mM 10بازتریس، EDAT، mM20، M44/0 كلرید سدیم) اضافه و سپس 20 میكرولیترٍSDS (10%) به تیوب اضافه می كنیم و بعد 5 میكرولیتر پروتئینازK (20 میلیگرم در میلی لیتر) به تیوب مربوطه اضافه می كنیم . تیوپ مربوط را در دمای 55 درجه به مدت 2 ساعت یا در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت یك شب قرار داده تا عمل هضم سلولی بخوبی صورت گیرد.100 میكرولیتر محلولNaCl اضافه می كنیم و10 الی30 دقیقه در یخ یا فریزر20 – قرار می دهیم. سپس سانتریفوژ با سرعت g13000 صورت می گیرد. جهت شستشوی رسوب مقدار اتانول 70% به میزان 5/0 میلی لیتر اضافه گردیده و با دور g13000 در دمای 4 درجه به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ صورت گرفت. بعد از خشك شدن رسوب DNA مقدار 100 میكرولیتر TE (mM1EDTA، 8 pH ، mM10 بازتریس 6/7 pH ) جهت حل شدن آن اضافه گردیده و سپس نمونه ها در20 – درجه سانتیگراد به منظور بررسی مولكولی نگهداری می شود(4) .
تخلیص DNA به روش تیوسولفات گوانیدین - سیلیكاژل
شیرحاوی انواع مختلفی از سلولها می باشد كه در مجموع سلولهای سوماتیك(Somatic Cell) نامیده می شود . در شیر به طور معمول سلولهای نوتروفیل، ماكروفاژ، لنفوسیت و ائوزینوفیل وسلولهای اپتلیال وجود دارد. به لحاظ وجود حساسیت شدید گاوهای بومی كشور و خوی نا آرام آنها كه همواره عملیات خونگیری را دچار مشكل كرده است ، دستیابی به DNA ژنومی از نمونه های شیر راه كم خطر و مناسبی به نظر می رسد.10 میلی لیتر نمونه شیر در داخل لوله های آزمایش درب دار حاوی فرمالدئید جمع آوری گردید و برای استخراج سانتریفوژ g10000 به مدت 10 دقیقه صورت پذیرفت و محلول روئی دور ریخته شد. سپس رسوب باقی مانده با محلول سالین شستشو داده شد . بقیه مراحل طبق روش تیوسولفات گوانیدین- سیلیكاژل انجام پذیرفت. 500 میكرولیتر بافر هضم كننده (M5 تیوسیونالات گوانیدن،mM 20EDTA،mM40 Tris،40 گرم ,TritonX10010 گرم DTT ) به نمونه شیر اضافه شده، نمونه ها به مدت 5 دقیقه در بن ما ری حاوی 65 درجه سانتیگرا د قرار گرفت. سپس 20 میكرولیتر محلول نوكلئاز(4 گرم ذرات سیلیكا،100 میكرولیترگوانیدین) اضافه شد و به مدت 10 دقیقه به آرامی ورتكس گردید. سپس به محیط همگن شده، 400 میكرو لیتر بافرسالین EDTA 20mM , Tris-HCl 10mM , KCl 1M , NaCl 1M ) ) اضافه و در نهایت از طریق ماده Extra Gene (10% رزین 02/0 % ماده رنگی OrangG،01/0 درصدTriton X 100 ) ، DNA زرد رنگ از سایر ناخالصیها جدا گردید(2) .
استخراج DNA از اسپرم و ریشه مو
استخراج DNA از پایتهای اسپرم با روشهای متداول ذكر شده امكان پذیر است، اما به جهت اینكه اسپرم مقدار زیادی كلسترول و نمك دارد، با استفاده از بافر ٍٍPBS، مقادیر كلسترول و نمك از رسوب شستشو می شود و سپس از روشهای ذكر شده می توان در ادامه استخراج استفاده نمود. در مورد ریشه مو قبل از استفاده از روشهای ذكر شده باید ریشه های مو با اتانل 70 % چربی زدائی شوند. سپس در روی یك كاغذ صافی در 65 درجه خشك شود. سپس 5/0 سانتیمتر از قسمتی كه حاوی ریشه های موی است با قیچی جدا می كنیم و در داخل تیوپ حاوی 100 میكرولیتر بافرA (200mM ، NaoH و DTT 50 mM ) قرار می دهیم و 15 دقیقه در دمای 97 درجه سانتیگراد حرارت می دهیم و سپس سایر مراحل را طبق روشهای ذكر شده انجام می دهیم .
آغازگرها
برای موفقیت و دقیق بودن واكنش زنجیره پلی مراز ، آغاز گرها از ویژگی خاصی باید برخوردار باشند. آغازگرتصادفی مورد استفاده برای واكنش RAPD، OPU13 خریراری شده از شركت Operon بود .و برای انجام تكنیك PCR-RFLP از پرایمرهای اختصاصی برای تكثیر بخشی از اینترون ژن لپتین استفاده شد. این دوجفت24 mer بودند كه ناحیه ای از اینترون دو ژن لپتین گاوی را تكثیر می سازد ساخت پرایمرها دوم توسط شركت روسی SYNTOL صورت پذیرفت. توالی مورد تكثیردر ژن بانك(EMBL) با شماره Y11369.1 موجود است.
واكنش زنجیره ای پلیمراز
مواد وغلظت مناسب برای 25 میكرولیتر واكنش تهیه گردید. انجامPCR با استفاده از كیتGenepak PCR Universal صورت گرفت. از مزایای این كیت اینست كه آنزیم Taq DNA پلی مراز به كمك آنتی بادی مهار شده است وتنها در درجه حرارت بالا ( بالای 90 درجه ) این آنتی بادی تخریب شده و آنزیم را رها می نماید لذا PCR به صورت Hot-Star انجام می گیرد. به تمام میكروتیوپها 10 میكرولیترPCR Diluent اضافه می كنیم و میزان غلظت آغاز گرهای مورد استفاده 20-10 پیكومول می باشد واكنش زنجیره پلی مراز برای تكثیر ژن لپتین در ترموسایكر با برنامه (دناتوره شدن اولیه 93 درجه سانتیگراد، به مدت 2 دقیقه، دمای اتصال 55 درجه به مدت یك دقیقه، دمای تكثیر 72 درجه به مدت1 دقیقه ، دمای دناتوره شدن 93 درجه سانتیگراد، به مدت 1 دقیقه، دمای تكثیر نهائی 72 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه ) با 33 سیكل انجام پذیرفت .برای واكنش PCR-RAPD ازبرنامه حرارتی، 94 درجه به مدت 2 دقیقه،94 درجه به مدت 30 ثانیه، 45 درجه به مدت 30 ثانیه، 72 درجه به مدرت 30 ثانیه و بسط نهایی 72 درجه به مدت 10 دقیقه در 45 سیكل استفاده گردید.
هضم آنزیمی
عمل هضم آنزیمی در حجم 30 میكرولیتر با مصرف 15 واحد آنزیمی تحت شرایط بافری و دمای مناسب با استفاده از آنزیم برشی Sau3AI كه سایت برشی GATC را شناسایی می كند صورت پذیرفت
الكتروفوز محصولات PCR و هضم
ابتدا آگارز 8/1 % با بكار گیری بافرTBE 1 ، ./09mM تریس ، ./09mM اسید بوریك و EDTA./02mM ) تهیه و به ازای هر10 میلی لیتر ژل 2/0 میكرو لیتر اتیدیوم بروماید (10mg/ml) به آن اضافه كرده و در ظرف مخصوص حاوی شانه ریخته می شود.بعد از بسته شدن ژل، به ازای 7 میكرولیتر محصول PCR با دومیكرولیتر لودینگ بافر( بروموفنل بلو 25/0 درصد، ساكارز40 % ) مخلوط نموده سپس در چاهكهای ژل قرار داده می شوند . با ولتاژ بالا حدود 100 ولت شروع تا اینكه نمونه ها از چاهك خارج شود سپس ولتاژ را به حدود 70 ولت رسانیده و سپس از یكساعت الكتروفورز نمونه ها با استفاده از دستگاه نور ماورا بنفش مورد بررسی قرار می گیرند

بحث:
نتایج نشان داد كه كیفیت و كمیت DNA حاصله و روش سیلیكا ژل و Salting out بهتر ومطلوبتر از روش جوشاندن است و از نظرفیزیكی نیزكمتر باعث فرسودگی DNA میشود. روش جوشاندن باعث ایجاد DNA بصورت اسمیر و حاوی پروتئین زیاد می شود غلظت DNA حاصله در روش جوشاندن 140-190mg/ml و در روش Salting out و سیلكاژل 400μg/ml محاسبه شد.
یك قطعه bp 422 از ژن لپتین كه شامل اینترون می شد توسط PCR تكثیرگردید و برای هضم آنزیمی از sau3AI استفاده شد.روش گوانیدین –تیوسولفات روش مناسبی است كه در آن ذارت سیلیكون به جای فنل و پرو پانل در رسوب دادنDNA از مخلوط لیز سلولها می باشد. در این روش در حضورغلظت بالای نمك سیلیكا به رشته های DNA چسبیده و آنها را رسوب می دهند و در حضور غلظتهای پایین نمك آن را رها می كنند و بنابراین از این خاصیت می توان به جای رسوب دادن اتانل یا ایزوپروپانل از این ذرات استفاده كرد. از مزایای دیگر این كیت اینست كه در مرحله نهایی DNA در فاز زرد رنگ قرار می گیرد و در نتیجه به آسانی قابل جا شدن از سایر ناخالصیهای نامطلوب می باشد. از این روش می توان از خون كهنه و یا حتی لخته شده نیز برای استخراج استفاده كرد.