tohidr
25th January 2010, 07:05 PM
كال زايي، اندام زايي و ريز ازديادي تاتورا انسيجنيس
چكيده –جداكشت هاي برگي و ساقه اي مشتق از داتوره انسيجنيس در محيط كشت پايه ي موراشيگ و اسكوگ (1962) حاوي غلظت ها و تركيبات مختلف NAA همراه با BA كشت داده شدند. پاسخ هاي مرفولوژيك جدا كشت هاي ساقه اي نشان دادند كه برهم كنش اين عوامل منجر به تكثير كالوس يا جوانه هوايي مي شود. بهترين پاسخ كال از جدا كشت هاي ساقه اي با استفاده از BA با غلظت هاي بالاي mg l-125/0 + 25/0 يا mg l-1 1 NAA بدست آمد. تركيبات حاوي غلظت هاي BA و NAA كمتر از 06/0 و mg l-1 2 به ترتيب، باززايي ريشه را در جدا كشت هاي برگ تسريع كردند. تشكيل جوانه از قطعات گرهي زماني كه NAA در غلظت هاي كمتر از mg l-1 06/0 استفاده شد، مشاهده گرديد. ميانگين ماهانه نرخ تكثير در حدود 81/14 جوانه در محيط كشت تكميل شده با NAA (mg l-1 004/0 ) + BA (mg l-1 25/0 ) بود. اندام هاي هوايي، زماني كه در محيط كشت گامبورگ(Exp. Cell. Res., 50:151-159, 1968) بدون تنظيم كننده هاي رشد و تكميل شده با كاركول فعال شده ( g l-1 3 ) كشت داده شدند، ريشه دادند و دراز شدند.
مقدمه
تاتورا اينسيجنيس، تيره سولاناسه، گياه استفاده شده درشكل دم كرده برگ، پخش شده درمراسم بوميان پرو و آمازون به خاطر اثرات روشن خواب آوري استفاده مي شد ( باربوسا رودريگز، 1891). آلكالوئيدهاي تروپاني اسكوپولامين (30/0 %) و هيوسيامين (02/0 %) از عصاره هاي برگ تاتورا انسيجنيس (رزيني و باستوس ، 1956) جداسازي شده اند. زيرا اين مواد در غلظت هاي بالايي در تاتورا انسيجنيس نسبت به بقيه گونه ها در اين جنس وجود دارند، ترجيحاً اين گياه در مطالعات دارو شناختي استفاده شده است.
كشت اين ويتروي تاتورا انسيجنيس مطلوب است، زيرا اين گونه نمي تواند دانه توليد كند(رزيني و باستوس ، 1956) ولي فقط از طريق رويشي تكثير مي يابد.ساير گونه هاي اين جنس از جنين (آوربك و همكاران، 1942)، كالوس (انگويلد، 1973)، بساك (گوآ و ماهشواري، 1964 ، 1966؛ گوپتا و بابر، 1980)، سوسپانسيون سلولي (هيروكا و تاباتا، 1974) و پروتوپلاست (شيدر 1976؛a,b1977) باززايي شده اند.
هدف مطالعه حاضر تعيين اثر NAA و BA بر كال زايي ، اندام زايي و ريز ازديادي كلونال اين گياه دارويي با به حداكثر رساندن ميزان تكثير توسط جدا كشت اوليه بود. بر اساس نتايج به دست آمده، توليد اين ويتروي گياهان، طرح هاي توليد و استخراج اسكوپولامين را در سطح تجارتي حمايت مي كند.
مواد و روش ها
ماتريك از نمونه هاي نگهداري شده در گلخانه دانشگاه فدرال ريودوژانيرو انتخاب شدند. شاخه ها به گلدان هاي سراميكي حاوي خاك سياه و كود آلي منتقل و در اتاق رشد در دماي C ◦ 2± 25 ، با دوره نوري 16 ساعت و شدت نوري mmolm-2s-1 23ايجاد شده توسط لامپ هاي فلورسانت W 20 فليپس افزون بر نور روز و لامپ هاي گرو- لوكس W 20 سيلوانيا نگهداري شدند. برگ هاي بالغ و قطعات گرهي گياهان تقريباً cm 20ي بالايي به عنوان جداكشت ها مورد استفاده قرار گرفتند. مواد (جداكشت ها) با اتانول 70% (3 دقيقه)، هيپوكلريت سديم 2% (2دقيقه) سترون و پس از هر مرحله با آب استريل شستشو داده شدند. جدا كشت هاي برگي رگبرگ اصلي با ميانگين سطحي 2- cm 1و در تماس با اپيدرم سطح دور از محوردر محيط كشت انكوبه شدند. قطعات گرهي داراي جوانه جانبي تقريباً cm 3/0تا 5/0 طول و cm 3/0 ضخامت بودند. جدا كشت ها در محيط كشت موراشيگ-اسكوگ (1962) ((MS نمكي تكميل شده با mg 1-1 5/0 تيامين-HCl، mg 1-1 5/0 اسيد نيكوتينيك، mg 1-1 5/0 پيرودوكسين، 100 mg 1-1 ميواينوزيتول، 1 mg 1-1 اسيد آسكوروبيك، 3% ساكاروز و تنظيم كننده هاي رشد در غلظت هاي زير: NAA – mg 1-1 4، 2، 1، 25/0، 06/0 ، 150/0 و 004/0 ؛ BA mg 1-1 2 ، 1، 25/0 ، 06/0 و 015/ كشت داده شدند. pH برروي 7/5 تنظيم شد و محيط كشت با g 1-1 7 آگار سفت گرديد. لوله هاي آزمايش (mm 150*25) محتوي ml 15 از محيط كشت در آزمايشات استفاده شدند. هر تيمار شامل 10 كشت با 2 تكرار بود و مواد در فواصل دو هفته اي ارزيابي شدند. كشت ها در اتاقي با دماي C◦2±25 ، با دوره نوري 16 ساعت، و شدت نوري mmolm-2s-123 نگهداري شدند. پس از 30 روز، جدا كشت ها درمحيط كشت همسان تركيبات شيميايي واكشت شدند. تكثير جوانه: جوانه هاي بدست آمده از تكثير قطعات گرهي و جوانه هاي جانبي، كشت داده شده در محيط كشت MS حاوي mg 1-1 25/0 BA + mg 1-1 004/0 NAA ارتفاعي بيش از cm 3/0 نشان دادند، در محيط كشت با تركيب مشابه واكشت شدند. اين روش در فواصل 30روزه در طي يك دوره 4 ماهه تكرار شد. تعداد ميانگين جوانه هاي تكوين يافته، درصد جوانه شكل گرفته و ضريب ازدياد برآورد شدند. جوانه ها ي تكثير يافته مجزا شده و آنهايي كه 4/0 تا 5/1 cm طول داشتند در محيط كشت MS و محيط كشت B5 (گامبورگ و همكاران، 1968) بدون تنظيم كننده هاي رشد و بدون كاركول فعال ( g 1-13) براي افزايش تشكيل و دراز شدن ريشه كشت داده شدند. تعداد بسياري از گياهچه هاي دراز شده به عنوان منبع جداكشت براي آزمايش هاي جديد استفاده شدند و براي ساير آزمايش هاي سازشي مورد مطالعه قرار گرفتند.
خوگيري. گياهچه هاي هاي ريشه دار شده با بخش هوايي تقريباً به اندازه cm 6 درازا بطور منفرد در فلاسك هاي محتوي مخلوط ماسه ، خاك سياه و ورميكوليت سترون (1:3:1) كاشته شدند و آنجا براي تقريباً 30 روز در اتاق كنترل شده از نظر آب وهوايي در دماي ◦C 2 ± 25 ، با دوره نوري 16 ساعته، و شدت نور mmol m-2s-1 23 ماندند. سپس گياهچه ها به گلدان هاي سراميكي استوانه اي (cm2 6280) محتوي خاك سياه و ماسه (1:3) منتقل شدند و تحت شرايط محيطي، آب دهي در فواصل 3 روزه ، ماندند.
نتايج
فعاليت تنظيم كننده هاي رشد بر روي جداكشت هاي داتورا اينسيجنيس به ما اجازه دسته بندي محيط هاي كشت آزمايش شده بر اساس پاسخ هاي مورفوژنيك مانند تشكيل كال، ريشه و گياهچه و ازدياد جوانه را داد.
تشكيل كال. غلظت هاي mg 1-1 NAA 4 - 25/0 در تركيب با BA (mg 1-1 1و2)، تكوين ، كال متراكم وبزرگ را، بويژه در راستاي سمت دور از محور رگبرگ مركزي تحريك كرد و پيش بردند (جدول 1). در قطعات گرهي تمام غلظت هاي آزمايش شده باستثناي تركيب هاي mg 1-1 015/0 NAA+ mg 1-1 06/0 يا 015/0 BA و mg 1-1 004/0 NAA + mg 1-1 015/0 BA ، رشد كال را پيش برد (جدول 2). همچنين اين كاهش تكوين كال متناسب با كاهش غلظت هاي تنظيم كننده هاي رشد بود. محيط كشت هاي حاوي mg 1-1 1 BA + mg 1-1 25/0 يا 1 NAA براي شكل گيري كال، مطلوب در نظر گرفته شدند. كال توليد شده توسط آنها پايدار متراكم ، بژ تا سفيد رنگ ، cm 28/0± 20/1 و cm 13/0 ± 98/0 قطر و وزن تر g 16/0 ± 70/0 و g 10/0 ± 53/0، به ترتيب، داشتند. بنابراين كال تكوين يافته نتوانست جنين توليد كند.
تشكيل ريشه. ريشه دارشدن جداكشت هاي برگي در محيط هاي كشت محتوي پايين ترين غلظت هاي BA اتفاق افتاد (mg 1-1 015/0 و 06/0) (جدول 1). تشكيل ريشه در سطوح دور و نزديك به محوروقتي محيط كشت با mg 1-1 25/0 NAA تكميل شد رخ داد. زماني كه از تركيب mg 1-1 015/0 BA + mg 1-1 06/0 NAA استفاده شد، تمام جداكشت ها ريشه هاي قوي، منشا گرفته از رگيرگ مركزي، توليد نمودند. شكل گيري ريشه ها از كالي كه در پايه رگبرگ مركزي(جدول1) و در ناحيه پايه اي جداكشت ساقه اي تكوين يافته بود هنگامي كه كال در محيط هاي كشت حاوي mg 1-1 015/0 BA و تكميل شده با NAA در غلظتي برابر يا كمتر از mg 1-1 06/ 0 كشت داده شد روي داد.
تشكيل جوانه. در جداكشت هاي برگي جوانه شكل نگرفت. داده هاي جدول2 نشان مي دهند كه محيط هاي كشت حاوي غلظت هاي پايين NAA در تركيب با كليه غلظت هاي آزمايش شده BA تكوين جوانه هاي جانبي را در قطعات گرهي تحريك كردند، قوي ترين جوانه هاي جانبي در محيط هاي كشت داراي mg 1-1 004/0 NAA + mg 1-1 015/0 BA بدست آمدند.
تكثير جوانه. از جدا كشت هاي ساقه اي كشت داده شده در محيط كشت محتوي mg 1-1 004/0 NAA + mg 1-1 25/0 BA ، % 86 به طور همزمان تكثيرجوانه جانبي و تشكيل جوانه نابه جا را به وسيله اندام زايي غيرمستقيم نشان دادند (جدول3، شكل2). ميانگين ماهانه سرعت تكثير براي هر جداكشت اوليه 81/14 جوانه بود. وقتي نمونه ها در محيط كشت B5 كشت داده شدند دراز شدن اندام هوايي زيادتر بود. حضور كاركول فعال زمان لازم براي تشكيل ريشه هاي نابه جا را از اندام هاي هوايي دراز شده كاهش داد. درصد تشكيل ريشه %90 بود و اندام هاي هوايي نگهداري شده در محيط كشت B5 تعداد بيشتري ريشه و ريشه هاي قوي، پس از 15 روز، نسبت به اندام هاي هوايي نگهداري شده در محيط كشت MS نشان دادند. تقريباً %96 گياهچه هاي ريزازديادي شده پس از مرحله خوگيري تكوين عادي نشان دادند و به عنوان منبع جداكشت براي آزمايش هاي بعدي مورد استفاده قرار گرفتند.
بحث و نتيجه گيري ها
فليك و همكاران (1983) و گراتا پاگليا و ماچادو (1990) گزارش دادند كه، به طور كلي محيط هاي كشت حاوي غلظت هاي بالاي اكسين و غلظت هاي پايين سيتوكينين تكثير سلولي را افزايش مي دهند كه منجر به تشكيل كال مي شود. نتايج بدست آمده توسط ما در آزمايش هاي مقدماتي با داتورا اينسيجنيس (فيگوردو و اسكويبل، 1988)، مجموعاً با نتايج ارائه شده در اينجا، علاوه بر تائيد اين نظريه، همچنين اثبات مي كند كه حتي در محيط هاي كشت با غلظت هاي پايين NAA (mg 1-1 004/0) كال زايي كاهش مي يابد. اين نتايج با نتايج بدست آمده توسط ورنيك و همكاران (1979) در مطالعه ي هيوسياموس موتيكوس (Hyoscyamus muticus)، همچنين متعلق به تيره سولاناسه مطابقت مي كنند.
مطالعات تشريحي درباره كال تشكيل يافته در محيط هاي كشت (mg 1-1 1 BA + mg 1-1 1 يا 25/0 NAA) به نظر مي رسد كه براي كال زايي ايدآل باشند كه نشان داده است اين نمونه ها جنين زا نيست و ساختار هاي پيراموني كروي نشان مي دهند، تمايز يابي عناصر چوبي، و مراكز مريستمي در سراسر كال پراكنده مي شوند (فيگوردو و همكاران، 1990).
طبق نظر لو و همكاران (1980)، غلظت بالاي سيتوكينين اين ويترو شروع دراز شدن ريشه را دچار اختلال مي كند. اسكوگ و ميلر (1957) و فليك و همكاران (1983) ملاحظه كردند استفاده از اكسين به تنهايي يا در تركيب با تراز هاي پايين سيتوكينين براي القاي پريمورديوم هاي ريشه ضروري است. در مطالعه حاضر، وجود BA در غلظت هاي پايين براي تشكيل ريشه در جداكشت هاي برگي و ساقه اي ضروري بود. ريشه هايي كه در امتداد و در پايه رگبرگ اصلي و در ناحيه ي پايه اي قطعه گرهي تكوين يافتند ويژگي هاي مرفولوژيكي مشابه با آنهايي كه در آزمايش قبلي با استفاده از IAA و KIN حاصل شدند، نشان دادند (فيگوردو و اسكوئيبل، 1987). اين نشان مي دهد كه براي گونه مورد مطالعه حضور سيتوكينين خارجي براي القا و توليد ريشه هاي نا به جا از جدا كشت هاي برگي و ساقه اي ضروريست.
نتايج موجود نشان مي دهند كه نسبت هاي اكسين: سيتوكينين كمتر از 1 تكوين جوانه هاي جانبي را تسريع كرد، كه نتايج به دست آمده با هيوسياموس موتيكوس Hyoscyamus muticus تائيد مي كند (ورنيك و همكاران، 1979). هرچند ثابت شده است كه غلظت BA خارجي در حدود mg 1-1 25/0 در تركيب با انواع مختلف اكسين براي تكثير جوانه ايده آل است، كشف شد كه بر هم كنش BA با مقدار كاهش يافته NAA (mg 1-1 004/0) كاراتر بود، كه منجر به سرعت تكثير 81/14، در مقابل 8/2 زماني كه BA در تركيب با 2,4D يا IAA استفاده گرديد (سانتوز و همكاران، 1990). همچنين حضور جوانه هاي نا به جاي حاصل شده به وسيله اندام زايي غير مستقيم با استفاده از NAA، اما نه با استفاده از 2,4D يا IAA (سانتوز و همكاران، 1990)، ملاحظه گرديد. فيگوردو و همكاران (1987) و سانتوز و همكاران (1990) مشاهده كردند كه استفاده از mg1-1 1 BA به تنهايي نيز تكثير جوانه را تسريع كرد، اگرچه سرعت تكثير پنج برابر كمتر ازآن وقتي كه BA در تركيب با NAA استفاده شد به دست آمد. پس از چهار واكشت، درصد تكثير (جدول 3) و قدرت زيستي جوانه افزايش يافت، با اين وجود هيو و وانگ (1983) پيشنهاد كردند كه توانايي تكثير برخي گونه ها پس از چند بار واكشت به سرعت كاهش مي يابد و سرانجام ممكن است توان مورفوژنتيك به طور كامل از دست برود.
از آنجايي كه گياهان ريزازديادي شده براي ريشه زايي به هورمون هاي خارجي نياز نداشتند، تفاوت ها در تعداد و نيرومندي ريشه به تفاوت در تركيب نمكي B5 و MS نسبت داده مي شوند.
جدول 3. تكثير جوانه جانبي حاصل از قطعه گرهي داتورا اينسيجنيس Datura insignis بارب. رودر. كشت داده شده در محيط كشت MS تكميل شده با mg 1-1 004/0 NAA + mg 1-1 25/0 BA.
تعداد اوليه ي تعداد نهايي جداكشت ها ي تعداد طول ضريب
جوانه هاي هر جوانه هاي هر داراي تكثير جوانه جوانه هاي جوانه اصلي تكثير
كشت كشت (%) بي شكل (mm) (CM)
10 131 85 50/5 ± 10/13 39/2 ± 84/4 13/11
75 1027 87 33/4 ± 70/13 17/2 ± 25/6 91/11
175 2622 84 63/6 ± 0/15 05/2 ± 70/6 60/12
75 1308 88 47/5 ± 44/17 87/2 ± 91/6 34/15
CM – درصد جدا كشت هاي داراي تكثير جوانه X تعداد اصلي جوانه هاي بي شكل / 100.
چكيده –جداكشت هاي برگي و ساقه اي مشتق از داتوره انسيجنيس در محيط كشت پايه ي موراشيگ و اسكوگ (1962) حاوي غلظت ها و تركيبات مختلف NAA همراه با BA كشت داده شدند. پاسخ هاي مرفولوژيك جدا كشت هاي ساقه اي نشان دادند كه برهم كنش اين عوامل منجر به تكثير كالوس يا جوانه هوايي مي شود. بهترين پاسخ كال از جدا كشت هاي ساقه اي با استفاده از BA با غلظت هاي بالاي mg l-125/0 + 25/0 يا mg l-1 1 NAA بدست آمد. تركيبات حاوي غلظت هاي BA و NAA كمتر از 06/0 و mg l-1 2 به ترتيب، باززايي ريشه را در جدا كشت هاي برگ تسريع كردند. تشكيل جوانه از قطعات گرهي زماني كه NAA در غلظت هاي كمتر از mg l-1 06/0 استفاده شد، مشاهده گرديد. ميانگين ماهانه نرخ تكثير در حدود 81/14 جوانه در محيط كشت تكميل شده با NAA (mg l-1 004/0 ) + BA (mg l-1 25/0 ) بود. اندام هاي هوايي، زماني كه در محيط كشت گامبورگ(Exp. Cell. Res., 50:151-159, 1968) بدون تنظيم كننده هاي رشد و تكميل شده با كاركول فعال شده ( g l-1 3 ) كشت داده شدند، ريشه دادند و دراز شدند.
مقدمه
تاتورا اينسيجنيس، تيره سولاناسه، گياه استفاده شده درشكل دم كرده برگ، پخش شده درمراسم بوميان پرو و آمازون به خاطر اثرات روشن خواب آوري استفاده مي شد ( باربوسا رودريگز، 1891). آلكالوئيدهاي تروپاني اسكوپولامين (30/0 %) و هيوسيامين (02/0 %) از عصاره هاي برگ تاتورا انسيجنيس (رزيني و باستوس ، 1956) جداسازي شده اند. زيرا اين مواد در غلظت هاي بالايي در تاتورا انسيجنيس نسبت به بقيه گونه ها در اين جنس وجود دارند، ترجيحاً اين گياه در مطالعات دارو شناختي استفاده شده است.
كشت اين ويتروي تاتورا انسيجنيس مطلوب است، زيرا اين گونه نمي تواند دانه توليد كند(رزيني و باستوس ، 1956) ولي فقط از طريق رويشي تكثير مي يابد.ساير گونه هاي اين جنس از جنين (آوربك و همكاران، 1942)، كالوس (انگويلد، 1973)، بساك (گوآ و ماهشواري، 1964 ، 1966؛ گوپتا و بابر، 1980)، سوسپانسيون سلولي (هيروكا و تاباتا، 1974) و پروتوپلاست (شيدر 1976؛a,b1977) باززايي شده اند.
هدف مطالعه حاضر تعيين اثر NAA و BA بر كال زايي ، اندام زايي و ريز ازديادي كلونال اين گياه دارويي با به حداكثر رساندن ميزان تكثير توسط جدا كشت اوليه بود. بر اساس نتايج به دست آمده، توليد اين ويتروي گياهان، طرح هاي توليد و استخراج اسكوپولامين را در سطح تجارتي حمايت مي كند.
مواد و روش ها
ماتريك از نمونه هاي نگهداري شده در گلخانه دانشگاه فدرال ريودوژانيرو انتخاب شدند. شاخه ها به گلدان هاي سراميكي حاوي خاك سياه و كود آلي منتقل و در اتاق رشد در دماي C ◦ 2± 25 ، با دوره نوري 16 ساعت و شدت نوري mmolm-2s-1 23ايجاد شده توسط لامپ هاي فلورسانت W 20 فليپس افزون بر نور روز و لامپ هاي گرو- لوكس W 20 سيلوانيا نگهداري شدند. برگ هاي بالغ و قطعات گرهي گياهان تقريباً cm 20ي بالايي به عنوان جداكشت ها مورد استفاده قرار گرفتند. مواد (جداكشت ها) با اتانول 70% (3 دقيقه)، هيپوكلريت سديم 2% (2دقيقه) سترون و پس از هر مرحله با آب استريل شستشو داده شدند. جدا كشت هاي برگي رگبرگ اصلي با ميانگين سطحي 2- cm 1و در تماس با اپيدرم سطح دور از محوردر محيط كشت انكوبه شدند. قطعات گرهي داراي جوانه جانبي تقريباً cm 3/0تا 5/0 طول و cm 3/0 ضخامت بودند. جدا كشت ها در محيط كشت موراشيگ-اسكوگ (1962) ((MS نمكي تكميل شده با mg 1-1 5/0 تيامين-HCl، mg 1-1 5/0 اسيد نيكوتينيك، mg 1-1 5/0 پيرودوكسين، 100 mg 1-1 ميواينوزيتول، 1 mg 1-1 اسيد آسكوروبيك، 3% ساكاروز و تنظيم كننده هاي رشد در غلظت هاي زير: NAA – mg 1-1 4، 2، 1، 25/0، 06/0 ، 150/0 و 004/0 ؛ BA mg 1-1 2 ، 1، 25/0 ، 06/0 و 015/ كشت داده شدند. pH برروي 7/5 تنظيم شد و محيط كشت با g 1-1 7 آگار سفت گرديد. لوله هاي آزمايش (mm 150*25) محتوي ml 15 از محيط كشت در آزمايشات استفاده شدند. هر تيمار شامل 10 كشت با 2 تكرار بود و مواد در فواصل دو هفته اي ارزيابي شدند. كشت ها در اتاقي با دماي C◦2±25 ، با دوره نوري 16 ساعت، و شدت نوري mmolm-2s-123 نگهداري شدند. پس از 30 روز، جدا كشت ها درمحيط كشت همسان تركيبات شيميايي واكشت شدند. تكثير جوانه: جوانه هاي بدست آمده از تكثير قطعات گرهي و جوانه هاي جانبي، كشت داده شده در محيط كشت MS حاوي mg 1-1 25/0 BA + mg 1-1 004/0 NAA ارتفاعي بيش از cm 3/0 نشان دادند، در محيط كشت با تركيب مشابه واكشت شدند. اين روش در فواصل 30روزه در طي يك دوره 4 ماهه تكرار شد. تعداد ميانگين جوانه هاي تكوين يافته، درصد جوانه شكل گرفته و ضريب ازدياد برآورد شدند. جوانه ها ي تكثير يافته مجزا شده و آنهايي كه 4/0 تا 5/1 cm طول داشتند در محيط كشت MS و محيط كشت B5 (گامبورگ و همكاران، 1968) بدون تنظيم كننده هاي رشد و بدون كاركول فعال ( g 1-13) براي افزايش تشكيل و دراز شدن ريشه كشت داده شدند. تعداد بسياري از گياهچه هاي دراز شده به عنوان منبع جداكشت براي آزمايش هاي جديد استفاده شدند و براي ساير آزمايش هاي سازشي مورد مطالعه قرار گرفتند.
خوگيري. گياهچه هاي هاي ريشه دار شده با بخش هوايي تقريباً به اندازه cm 6 درازا بطور منفرد در فلاسك هاي محتوي مخلوط ماسه ، خاك سياه و ورميكوليت سترون (1:3:1) كاشته شدند و آنجا براي تقريباً 30 روز در اتاق كنترل شده از نظر آب وهوايي در دماي ◦C 2 ± 25 ، با دوره نوري 16 ساعته، و شدت نور mmol m-2s-1 23 ماندند. سپس گياهچه ها به گلدان هاي سراميكي استوانه اي (cm2 6280) محتوي خاك سياه و ماسه (1:3) منتقل شدند و تحت شرايط محيطي، آب دهي در فواصل 3 روزه ، ماندند.
نتايج
فعاليت تنظيم كننده هاي رشد بر روي جداكشت هاي داتورا اينسيجنيس به ما اجازه دسته بندي محيط هاي كشت آزمايش شده بر اساس پاسخ هاي مورفوژنيك مانند تشكيل كال، ريشه و گياهچه و ازدياد جوانه را داد.
تشكيل كال. غلظت هاي mg 1-1 NAA 4 - 25/0 در تركيب با BA (mg 1-1 1و2)، تكوين ، كال متراكم وبزرگ را، بويژه در راستاي سمت دور از محور رگبرگ مركزي تحريك كرد و پيش بردند (جدول 1). در قطعات گرهي تمام غلظت هاي آزمايش شده باستثناي تركيب هاي mg 1-1 015/0 NAA+ mg 1-1 06/0 يا 015/0 BA و mg 1-1 004/0 NAA + mg 1-1 015/0 BA ، رشد كال را پيش برد (جدول 2). همچنين اين كاهش تكوين كال متناسب با كاهش غلظت هاي تنظيم كننده هاي رشد بود. محيط كشت هاي حاوي mg 1-1 1 BA + mg 1-1 25/0 يا 1 NAA براي شكل گيري كال، مطلوب در نظر گرفته شدند. كال توليد شده توسط آنها پايدار متراكم ، بژ تا سفيد رنگ ، cm 28/0± 20/1 و cm 13/0 ± 98/0 قطر و وزن تر g 16/0 ± 70/0 و g 10/0 ± 53/0، به ترتيب، داشتند. بنابراين كال تكوين يافته نتوانست جنين توليد كند.
تشكيل ريشه. ريشه دارشدن جداكشت هاي برگي در محيط هاي كشت محتوي پايين ترين غلظت هاي BA اتفاق افتاد (mg 1-1 015/0 و 06/0) (جدول 1). تشكيل ريشه در سطوح دور و نزديك به محوروقتي محيط كشت با mg 1-1 25/0 NAA تكميل شد رخ داد. زماني كه از تركيب mg 1-1 015/0 BA + mg 1-1 06/0 NAA استفاده شد، تمام جداكشت ها ريشه هاي قوي، منشا گرفته از رگيرگ مركزي، توليد نمودند. شكل گيري ريشه ها از كالي كه در پايه رگبرگ مركزي(جدول1) و در ناحيه پايه اي جداكشت ساقه اي تكوين يافته بود هنگامي كه كال در محيط هاي كشت حاوي mg 1-1 015/0 BA و تكميل شده با NAA در غلظتي برابر يا كمتر از mg 1-1 06/ 0 كشت داده شد روي داد.
تشكيل جوانه. در جداكشت هاي برگي جوانه شكل نگرفت. داده هاي جدول2 نشان مي دهند كه محيط هاي كشت حاوي غلظت هاي پايين NAA در تركيب با كليه غلظت هاي آزمايش شده BA تكوين جوانه هاي جانبي را در قطعات گرهي تحريك كردند، قوي ترين جوانه هاي جانبي در محيط هاي كشت داراي mg 1-1 004/0 NAA + mg 1-1 015/0 BA بدست آمدند.
تكثير جوانه. از جدا كشت هاي ساقه اي كشت داده شده در محيط كشت محتوي mg 1-1 004/0 NAA + mg 1-1 25/0 BA ، % 86 به طور همزمان تكثيرجوانه جانبي و تشكيل جوانه نابه جا را به وسيله اندام زايي غيرمستقيم نشان دادند (جدول3، شكل2). ميانگين ماهانه سرعت تكثير براي هر جداكشت اوليه 81/14 جوانه بود. وقتي نمونه ها در محيط كشت B5 كشت داده شدند دراز شدن اندام هوايي زيادتر بود. حضور كاركول فعال زمان لازم براي تشكيل ريشه هاي نابه جا را از اندام هاي هوايي دراز شده كاهش داد. درصد تشكيل ريشه %90 بود و اندام هاي هوايي نگهداري شده در محيط كشت B5 تعداد بيشتري ريشه و ريشه هاي قوي، پس از 15 روز، نسبت به اندام هاي هوايي نگهداري شده در محيط كشت MS نشان دادند. تقريباً %96 گياهچه هاي ريزازديادي شده پس از مرحله خوگيري تكوين عادي نشان دادند و به عنوان منبع جداكشت براي آزمايش هاي بعدي مورد استفاده قرار گرفتند.
بحث و نتيجه گيري ها
فليك و همكاران (1983) و گراتا پاگليا و ماچادو (1990) گزارش دادند كه، به طور كلي محيط هاي كشت حاوي غلظت هاي بالاي اكسين و غلظت هاي پايين سيتوكينين تكثير سلولي را افزايش مي دهند كه منجر به تشكيل كال مي شود. نتايج بدست آمده توسط ما در آزمايش هاي مقدماتي با داتورا اينسيجنيس (فيگوردو و اسكويبل، 1988)، مجموعاً با نتايج ارائه شده در اينجا، علاوه بر تائيد اين نظريه، همچنين اثبات مي كند كه حتي در محيط هاي كشت با غلظت هاي پايين NAA (mg 1-1 004/0) كال زايي كاهش مي يابد. اين نتايج با نتايج بدست آمده توسط ورنيك و همكاران (1979) در مطالعه ي هيوسياموس موتيكوس (Hyoscyamus muticus)، همچنين متعلق به تيره سولاناسه مطابقت مي كنند.
مطالعات تشريحي درباره كال تشكيل يافته در محيط هاي كشت (mg 1-1 1 BA + mg 1-1 1 يا 25/0 NAA) به نظر مي رسد كه براي كال زايي ايدآل باشند كه نشان داده است اين نمونه ها جنين زا نيست و ساختار هاي پيراموني كروي نشان مي دهند، تمايز يابي عناصر چوبي، و مراكز مريستمي در سراسر كال پراكنده مي شوند (فيگوردو و همكاران، 1990).
طبق نظر لو و همكاران (1980)، غلظت بالاي سيتوكينين اين ويترو شروع دراز شدن ريشه را دچار اختلال مي كند. اسكوگ و ميلر (1957) و فليك و همكاران (1983) ملاحظه كردند استفاده از اكسين به تنهايي يا در تركيب با تراز هاي پايين سيتوكينين براي القاي پريمورديوم هاي ريشه ضروري است. در مطالعه حاضر، وجود BA در غلظت هاي پايين براي تشكيل ريشه در جداكشت هاي برگي و ساقه اي ضروري بود. ريشه هايي كه در امتداد و در پايه رگبرگ اصلي و در ناحيه ي پايه اي قطعه گرهي تكوين يافتند ويژگي هاي مرفولوژيكي مشابه با آنهايي كه در آزمايش قبلي با استفاده از IAA و KIN حاصل شدند، نشان دادند (فيگوردو و اسكوئيبل، 1987). اين نشان مي دهد كه براي گونه مورد مطالعه حضور سيتوكينين خارجي براي القا و توليد ريشه هاي نا به جا از جدا كشت هاي برگي و ساقه اي ضروريست.
نتايج موجود نشان مي دهند كه نسبت هاي اكسين: سيتوكينين كمتر از 1 تكوين جوانه هاي جانبي را تسريع كرد، كه نتايج به دست آمده با هيوسياموس موتيكوس Hyoscyamus muticus تائيد مي كند (ورنيك و همكاران، 1979). هرچند ثابت شده است كه غلظت BA خارجي در حدود mg 1-1 25/0 در تركيب با انواع مختلف اكسين براي تكثير جوانه ايده آل است، كشف شد كه بر هم كنش BA با مقدار كاهش يافته NAA (mg 1-1 004/0) كاراتر بود، كه منجر به سرعت تكثير 81/14، در مقابل 8/2 زماني كه BA در تركيب با 2,4D يا IAA استفاده گرديد (سانتوز و همكاران، 1990). همچنين حضور جوانه هاي نا به جاي حاصل شده به وسيله اندام زايي غير مستقيم با استفاده از NAA، اما نه با استفاده از 2,4D يا IAA (سانتوز و همكاران، 1990)، ملاحظه گرديد. فيگوردو و همكاران (1987) و سانتوز و همكاران (1990) مشاهده كردند كه استفاده از mg1-1 1 BA به تنهايي نيز تكثير جوانه را تسريع كرد، اگرچه سرعت تكثير پنج برابر كمتر ازآن وقتي كه BA در تركيب با NAA استفاده شد به دست آمد. پس از چهار واكشت، درصد تكثير (جدول 3) و قدرت زيستي جوانه افزايش يافت، با اين وجود هيو و وانگ (1983) پيشنهاد كردند كه توانايي تكثير برخي گونه ها پس از چند بار واكشت به سرعت كاهش مي يابد و سرانجام ممكن است توان مورفوژنتيك به طور كامل از دست برود.
از آنجايي كه گياهان ريزازديادي شده براي ريشه زايي به هورمون هاي خارجي نياز نداشتند، تفاوت ها در تعداد و نيرومندي ريشه به تفاوت در تركيب نمكي B5 و MS نسبت داده مي شوند.
جدول 3. تكثير جوانه جانبي حاصل از قطعه گرهي داتورا اينسيجنيس Datura insignis بارب. رودر. كشت داده شده در محيط كشت MS تكميل شده با mg 1-1 004/0 NAA + mg 1-1 25/0 BA.
تعداد اوليه ي تعداد نهايي جداكشت ها ي تعداد طول ضريب
جوانه هاي هر جوانه هاي هر داراي تكثير جوانه جوانه هاي جوانه اصلي تكثير
كشت كشت (%) بي شكل (mm) (CM)
10 131 85 50/5 ± 10/13 39/2 ± 84/4 13/11
75 1027 87 33/4 ± 70/13 17/2 ± 25/6 91/11
175 2622 84 63/6 ± 0/15 05/2 ± 70/6 60/12
75 1308 88 47/5 ± 44/17 87/2 ± 91/6 34/15
CM – درصد جدا كشت هاي داراي تكثير جوانه X تعداد اصلي جوانه هاي بي شكل / 100.