بررسي تنوع و انگشت‌نگاري ژنتيكي ارقام زراعي كلكسيون پسته ايران(بر گرفته از پایان نامه)

[moji5]

نگارش :
احمد رضايي كمال آبادي
استاد راهنما :
دكتر جواد مظفري
اساتيد مشاور :
دكتر امان الله جوانشاه
دكتر محمدرضا قنادها


تجزيه خوشه‌اي ارقام پسته براساس صفات مورفولوژيك
براي طبقه بندي تنوع ژنتيكي مشاهده شده، برآورد فواصل ژنتيكي و ارتباط خويشاوندي ارقام پسته موجود در كلكسيونها روش تجزيه چند متغييره خوشه‌اي استفاده ‌شد. اين روش به ويژه در مواردي كه با تعداد زيادي ژرم پلاسم سر و كار داريم بسيار مفيد است زيرا پژوهشگر با انتخاب صحيح رقم‌ها در كلاسترهاي دور و با تشكيل بلوك‌هاي دو رگ‌گيري بين رقمهاي غير خويشاوند به نتايج منطقي‌تري دست خواهد يافت. هرچه فاصله رقم‌هاي مورد استفاده در دورگ گيري بيشتر باشد در نسلهاي تفكيك بعد از دو رگ‌گيري تنوع بيشتري ايجاد گردد. تلاقي بين رقم‌هاي دور نتاج مطلوب‌تري خواهد داد. و نتايج حاصل داراي هتروزيس بيشتري نسبت به دو دسته‌اي خواهند بود كه در يك كلاستر قرار دارند بدين ترتيب امكان تركيب ژنهاي بيشتر و مطلوب تر به نتاج بيشتر خواهد بود.
دندروگرام حاصل از تجزيه خوشه‌اي 114 صفت مورفولوژيك كمي و كيفي به روش UPGMA دو خوشه بزرگ واصلي ايجاد كرده و رقم پوست پيازي را از همة ارقام جدا نمود با ايجاد خط برش در فاصله 31/30198 (مربع فاصله) پنج گروه متمايزايجاد شد .
گروه اول داراي ويژگيهايي مانند عادت رشد گسترده، مرحله تمام گل متوسط، رنگ برگ سبز زيتوني، قطر دمبرگ متوسط، مقطع عرضي دمبرگ بيضي شكل، عرض كم جوانه گل، تراكم متوسط خوشه و با صفات ميوه رنگ سرخ قسمت شكمي مغز، شروع رنگ رسيدن از كناره­ها مي­باشد ارقامي مانند اوحدي، فندقي 48 و اكبري از اين گروه مي­باشند .
گروه دوم داراي ويژگيهايي مانند ارتفاع درخت بلند و درصد برگهاي سه برگچه­اي متوسط و درصد برگهاي پنج برگچه­اي زياد و طول برگ زياد و عرض برگ زياد و طول دمبرگ بلند و طول جوانه گل زياد و تعداد انشعابات اوليه خوشه زياد و وزن خشك پسته­هاي خندان خوشه زياد و درصد پسته­هاي دهان بسته با مغز كامل خوشه زياد و عرض بزرگتر از قطر پسته و عرض بزرگتر از مغز و درصد وزني مغز به نسبت وزن تر با پوست ميوه كم مي­باشند در اين گروه رقم حيدرآبادي به تنهايي قرار گرفته است .
گروه سوم داراي ويژگيهايي مانند اكثراً پنج برگچه­اي و وجود رگه­هاي قرمز رنگ روي محور خوشه و قطر مغز زياد مي­باشند اكثر ارقام پسته هاي ايراني در اين گروه قرار دارند كه از آن جمله مي­توان به ارقامي مانند كله قوچي و بهشت آبادي اشاره نمود .
گروه چهارم داراي ويژگيهايي مانند كمترين فاصله برگچه انتهايي و بيشترين وزن خوشه ميوه و بيشترين تعداد پسته­هاي خوشه ميوه و فاصله نوك درون بر استخواني تا مغز متوسط و رنگ درون بر استخواني تيره و درصد وزني مغز به نسبت وزن تر با پوست ميوه زياد مي­باشد. اين ويژگيها باعث شده است رقم ايتاليائي جدا ازگروه سوم ولي با اين گروه دريك خوشه قرار گيرد اين موضوع نشان دهنده تيپ متفاوت اين رقم از ارقام تجاري وهمچنين بقيه ارقام مي­باشد .
رقم پوست پبازي به تنهايي در گروه پنجم قرار گرفت كه داراي ويژگيهايي مانند بيشترين عرض برگ و بيشترين مساحت برگ و بيشترين وزن تر جوانه گل و بيشترين قطر جوانه گل و بيشترين قطر دم خوشه و بيشترين طول دم ميوه و كمترين تعداد انشعابات ثانويه روي اولين انشعابات اوليه خوشه و داراي ميوه­هاي پوك در شرايط معمولي مي باشد .
http://www.pri.ir/uploadedfiles/clust1.jpg




دندروگرام حاصل از تجزيه كلاستر ارقام پسته بومي ايران با استفاده از 114 صفت مورفولوژيك كمي و كيفي به روش UPGMA.




ارزيابي مولكولي:

براي بررسي تنوع ژنتيكي مبتني بر نشانگرهاي مولكولي از تكنيك RAPD استفاده شد.
تعداد 80 آغازگر تصادفي از سري آغازگرهاي تهيه شده توسط شركت (UBC)‌ University British of Colombia و شركت Operon (OP) استفاده شد. پس از تست پرايمرتعداد 15 آغازگر كه چندشكلي خوبي را در مورد ارقام پسته نشان دادند انتخاب شدند و در مراحل آزمايش به كار گرفته شدند.



توالي نوكلئوتيدهاي آغازگرهاي انتخابي





توالي آغازگر






آغازگر







GTG ACG CCG C





UBC 103




CAG CGA ACT A





UBC 213




CAC GGC TGC G





UBC 348




GCG GCC CTC T





UBC 356




CTG CTG GGA C





OPB 10




AGG GAA CGA G





OPB 17




GAT GAC CGC C





OPC 05




AGT CCG CCT G





OPAC 19




CTG AAC CGC T





OPAD 02




GAA CGA GGG T





OPAD 14




AGG AGC TGC C





MG 11




CCC GCG AGT C





MG 12




GAA GAA CCG C





MG 16




CAG CGT TGC C





AJ 05




ACA CGT GGT C





AJ 20


قطعات DNA تكثير شده از ژنوم پسته بر اساس آغازگرهاي تصادفي. نوارهاي DNA درهر صفحه عبارتند از :
1- اوحدي 2- كله قوچي 3- فندقي غفوري 4- سيف‌الديني 5- بادامي نيش‌كلاغي 6- فندقي زودرس 7- سبز پسته نوق 8- غلامرضايي 9- بادامي زرند 10- خنجري دامغان 11- رضايي زودرس 12- هراتي 13- موسي آبادي 14- بادامي راور 15- حسني 16- سيريزي 17- نشانگر Ladder 18- بياضي (پوست پيازي) 19- راور شماره 1 20- راور شماره 2 21- راور شماره 3 22- ابراهيم آبادي 23- اكبري 24- احمد آقايي 25- حسن زاده 26- محسني 27- ابراهيمي 28- شاهپسند 29- فندقي ريز 30- جندقي 31- فندقي48 32- قزويني 33- ايتاليايي 34- خنجري راور 35- ممتاز تاج آبادي 36- لك سيريزي 37- بهشت آبادي 38- شستي 39- سفيد پسته نوق 40- ممتاز 41- اميري 42- غفوري 43- واحدي 44- جواد آقايي 45- پوست خرمايي 46- لاهيجاني 47- سلطاني 48- جباري ناصريه 49- ايتاليايي درشت 50- نشانگر Ladder 51- ايتاليايي ريز 52- چروك خورده 53- سعيد آبادي 54- عامري 55- بادامي كج 56- كريم آبادي ناصريه 57- پوست خرمايي غفوري 58- خانداني 59- عبدالهي 60- كريم آبادي كرمان 61- حيدرآبادي 62- محي‌الديني 63- فروتني 64- پوست كاغذي 65- ركن آبادي 66- نيش كلاغي.


http://www.pri.ir/uploadedfiles/AGHAZGAR%20UBC%20103.JPG
http://www.pri.ir/uploadedfiles/AGHAZGAR%20UBC213.JPG
http://www.pri.ir/uploadedfiles/AGHAZGAR%20UBC%20348.JPG
http://www.pri.ir/uploadedfiles/AGHAZGAR%20UBC356...JPG


http://www.pri.ir/uploadedfiles/AGHAAZGAR%20OPB10.JPG
http://www.pri.ir/uploadedfiles/AGHAZGAR%20%20OPC05.JPG
http://www.pri.ir/uploadedfiles/AGHAZGAR%20OPB%2017.JPG
http://www.pri.ir/uploadedfiles/AGHAZGAR%20OPAD02.JPG
http://www.pri.ir/uploadedfiles/AGHAZGAR%20OPAD14.JPG
http://www.pri.ir/uploadedfiles/AGHAZGAR%20OPAC19.JPG
http://www.pri.ir/uploadedfiles/AGHAZGAR%20AJ05.JPG
http://www.pri.ir/uploadedfiles/AGHAZGAR%20AJ20.JPG
http://www.pri.ir/uploadedfiles/AGHAZGAR%20MG11.JPG
http://www.pri.ir/uploadedfiles/AGHAZGAR%20MG12.JPG
http://www.pri.ir/uploadedfiles/AGAZGAR%20MG16.JPG


ارتباط و فاصلة ژنتيكي ارقام پسته بومي ايران با استفاده از نشانگر RAPD
تجزيه خوشه­اي ارقام پسته براساس نشانگرهاي مولكولي RAPD به روش UPGMA و ضرايب تشابه جاكارد بيشترين تشابه ژنتيكي بين ارقام عامري و بادامي كج با ضريب تشابه 770/0 و سپس بين ارقام شاهپسند و فندقي ريز با ضريب تشابه 765/0 مشاهده شد و كمترين تشابه ژنتيكي مربوط به ارقام اوحدي و پوست خرمايي غفوري با ضريب تشابه 258/0 و سپس بين كله قوچي و محي الديني با ضريب تشابه 264/0 مي‌باشد ميانگين تشابه كل ماتريس براي تمامي ارقام 497/0 مي‌باشد.
دندروگرام حاصل دو خوشه ايجاد كرد كه منجر به توليد 5 گروه شد ، خط برش دندروگرام در فاصله 48/0 ترسيم شد كه در اين تجزيه رقم اوحدي و كله قوچي را در يك كلاستر و مابقي ارقام به طور كلي در دو شاخه اصلي قرار گرفتند. در يكي از اين شاخه­ها فقط يك رقم رضائي زودرس مشاهده مي­شود و شاخه ديگر شامل سه گروه بزرگ مي­باشد: به اين ترتيب در مجموع ارقام موجود در كلكسيون­هاي پسته به پنج گروه با ويژگيهاي زير طبقه بندي شد.
گروه اول در بر گيرنده ارقام تجاري معروف اوحدي و كله قوچي داراي 22 ويژگي مشترك مورفولوژيك مي­باشد كه مهمترين آنها شكل پسته خشك و شكل مغزمي باشد.
گروه دوم داراي ويژگي­هاي مشتركي مانند رنگ برگ سبز زيتوني و مقطع عرضي تنه درخت گرد مي­باشد كه از ارقام اين گروه مي­توان فندقي غفوري و سيف­الديني و.... نام برد.
گروه سوم داراي ويژگي­هاي مشتركي مانند اندازه برگچه انتهايي بزرگتر و از لحاظ زمان رسيدن متوسط رس مي­باشند. كه از ارقام اين گروه مي­توان بادامي زرند و هراتي و ... نام برد
گروه چهارم داراي ويژگي­هاي مشتركي مانند عادت رشد گسترده و رنگ تنه سفيد متمايل به خاكستري و اندازه برگچه انتهايي بزرگتر و رنگ برگ سبز زيتوني و عرض مغز متوسط مي باشند. كه از ارقام اين گروه مي­توان بهشت آبادي و ... نام برد .
گروه پنجم كه در بر گيرنده فقط يك رقم بنام رقم رضايي زودرس مي­باشد كه داراي ويژگيهايي مانند تيپ ميوه فندقي و زودرس بوده كه نظر ژنتيكي از ديگر ارقام رايج متمايز مي­باشد .




http://www.pri.ir/uploadedfiles/clust2.jpg
دندروگرام حاصل از تجزيه خوشه اي ضرايب تشابه الگوي DNA تكثير شده بر اساس 15 آغازگر RAPD در ارقام پسته ايران به روش UPGMA

مقايسه تنوع ژنتيكي براساس نشانگرهايRAPD با تنوع ژنتيكي براساس صفات مورفولوژيك
با مقايسه دندروگرام حاصل از صفات مورفولوژيك با دندروگرام حاصل از داده‌هاي RAPD به نظر مي‌رسد كه الگوي تنوع ژنتيكي براساس دو روش مذكور در بررسي ارقام پسته مطابق يكديگر هستند. همبستگي بين ماتريس فاصلة ارقام پسته براساس RAPD با ماتريس‌هاي حاصل از 114 صفت مورفولوژيك 11129/0-=r بود كه احتمال آن معني‌دار مي‌باشد (P>%5) و t-test= -2/0844 مي‌باشد.
نتايج حاصل از طبقه‌بندي برخي ارقام پسته بر اساس صفات مورفولوژيك با طبقه‌بندي ارقام پسته بر اساس نشانگر RAPD مطابقت داشت. تجزيه خوشه اي صفات مورفولوژيك سه گروه ايجاد كرد كه در گروه اول ارقام اكبري، ممتاز تاج آبادي، احمد آقايي، حسن‌زاده، فندقي ريز، كله قوچي قرار گرفتند. بجز رقم ممتاز تاج‌آبادي بقيه ارقام در گروه‌بندي مولكولي در يك گروه قرار داشتند اين گروه در25 واحد فاصله به دو گروه تقسيم مي‌شود كه اين ارتباط مي‌تواند بدليل مشابهت از نظر صفاتي مانند طول برگچه، عرض برگچه، وزن پسته‌هاي خندان خوشه، انس خندان، طول پسته خشك، طول مغز، اختلاف بين ابتدا و انتهاي شاخه رشد سال جاري و فاصلة نوك درون‌بر استخواني تا مغز باشد و نيز حضور ارقام غلامرضايي، بادامي‌راور، خنجري دامغان و حسني با هم در گروه دوم قرار گرفتند.


ارقام پسته بومي ايران موجود در كلكسيون­هاي مؤسسه تحقيقات پسته از نظر صفاتي مانند قطر وسط شاخه سال جاري بيشترين ضريب تغييرات و از نظر صفاتي مانند طول برگ كمترين ضريب تغييرات را نشان مي­دهند
همبستگي قوي و معني­داري (5/0r>) در بين صفات برگ، صفات ميوه، صفات خوشه و گروههاي مختلف صفات وجود دارد كه براساس آن مي­توان تعداد صفات مورد اندازه­گيري را براي بررسي تنوع ژنتيكي كاهش داد.
در تجزيه به مؤلفه هاي اصلي 26 مولفه شناسايي گرديد كه از اين تعداد 8 مؤلفه اول بيشترين مقادير ويژه را داشتند. مؤلفه اول و دوم تنها 01/29 درصد از كل واريانس را توجيه كردند كه نشان دهنده تنوع زياد پسته­هاي ايراني است.
تجزيه خوشه­اي 114 صفت مورفولوژيك به روش UPGMA منجر به توليد 5 گروه شد. در اين تجزيه رقم پوست پيازي به تنهايي از ارقام ديگر جدا شده و مابقي ارقام به طور كلي در دو شاخه اصلي كه هر يك شامل دو گروه بودند طبقه­بندي گرديد. اين موضوع نشان دهنده تفاوت ژنتيكي قابل توجه رقم پسته ايتاليايي (غير بومي ايراني) از ارقام پسته بومي ايران مي­تواند باشد اگر چه همه از ايران منشاء گرفته­اند
در تجزيه خوشه­اي ارقام پسته براساس نشانگر مولكولي RAPD به روش UPGMA و ضرايب تشابه جاكارد پنج گروه حاصل شد كه به طور كلي دو شاخه اصلي ايجاد گرديد كه ارقام اوحدي و كله قوچي در يك گروه و بقيه ارقام در شاخه ديگر در چهار گروه قرار گرفتند. در اين شاخه نيز رقم رضائي زودرس از بقيه ارقام جدا شده است.
استفاده از تكنيك RAPD براي شناسائي و طبقه­بندي ارقام پسته كاملاً مفيد و موثر مي باشد. اين روش در حداقل زمان و با كمترين هزينه تمايز خوبي را در بين ارقام پسته آشكار مي­نمايد.
همبستگي ضعيف و اما معني­دار در بين فواصل ژنتيكي ارقام پسته براساس صفات مورفولوژيك و نشانگر RAPD وجود دارد.
بر اساس نشانگرهاي مولكولي RAPD و صفات مورفولوژيك همة 64 رقم پسته ايران داراي ژنوتيپ مستقل وتمايز از همديگر بوده و تكراري نمي باشد.