سید لفته فردزاده
4th August 2015, 10:15 AM
پروتئین های نگهبان ژنوم به دو دسته کلی تقسیم می شوند:
الف: نگهبان دروازه سلولی (Gate keeper ):
اینها برروی سیکل سلولی عملکرد دارند و چنانچه سلول هنگام تقسیم سلولی دچار مشکل شود وارد عمل شده و از ورود سلول به مرحله بعدی تقسیم جلوگیری می کنند چنانچه مشکل به وجود آمده قابل برطرف شدن باشد تقسیم سلول تا برطرف شدن آن متوقف می شود و چنانچه مشکل قابل حل نباشد سلول موتاسیون پیدا کرده محکوم به فنا است . بنابراین از به وجود آمدن سلول سرطانی و موتاسیون یافته در سیکل سلولی جلوگیری خواهد شد.
ب: Tumor suppressor ها :
یا پروتئینهای سرکوبگر که نقش حفاظتی و ترمیمی ژنوم را به عهده دارند در هنگام همانند سازی از روی DNA چنانچه موتاسیونی اتفاق بیفتد وارد عمل می شوند و باز تا برطرف شدن نقص به وجود آمده کلیه فعالیتهای همانند سازی متوقف می شود.
سیکل سلولی شامل مراحلی است که سلول در آن آمادگی پیدا می کند تا تقسیم انجام دهد این تقسیم می تواند میتوز یا میوز باشد. لازمه تقسیم در سلول ورود به مراحل مختلف است سلول در حالت استراحت در فاز G1 به سر می برد. هنگامیکه می خواهد تقسیم انجام شود از فاز G1 وارد فاز S می شود ، در فاز S همانند سازی کلیهْ مواد حیاتی سلول صورت می گیرد سپس سلول وارد فاز G2 می شود در این فاز یک استراحت کوتاهی انجام می شود و همانند سازی بعضی ازپروتئین های مورد نیاز سلول انجام می شودسپس سلول وارد فاز M یا تقسیم می شود.
سلولهایی که به هیچ وجه تقسیم نمی شوند وارد فاز G0 می شوند مثل سلولهای عصبی . بیشترین زمان را سلول در فاز G1 بسر می برد.
مرحله ورود به هر فاز از سیکل سلولی مرحله بسیار مهمی است. و باید سلول مورد ارزیابی ژنومیک قرار بگیرد به نقاط ورود به هر فاز نقاط Check point گفته می شوند، که این چک کردن به عهدهْGate keeper ها است و بین این فازها تومور سابرسورها فعال هستند.
ژن P53: در انسان P53 توسط ژن TP53 که بر روی بازوی کوچک کروموزوم ۱۷ قرار دارد کد می شود طول ژن ۲۰ هزار جفت باز می باشد که اگزون شمارهْ ۱ آن کد کننده نبوده و اولین اینترون نیز بسیار طویل و ۱۰ هزار جفت باز طول دارد. توالی کد کننده شامل ۵ ناحیه می باشد که اگزونهای ۲ ،۵،۶،۷،۸ این ژن به شدت در بین گونه های مهره داران حفاظت شده می باشد،یعنی دارای توالی ثابت است.
در انسان یک پلی مورفیسم شایع (تغییر توالی شایع) که منجر به جایگزینی آرژینین به جای پرولین در کدون ۷۲ این مولکول می شودوجود دارد. مطالعات زیادی بر روی اثر این تغییر توالی صورت گرفته که نشان می دهد فرد مستعد بروز بعضی از Cancer ها است. محل این ژن در سایر پستانداران بر روی کروموزومهای متفاوتی است برای مثال:در شامپانزه و اوران گوتان بر روی کروموزوم ۱۷، در موش کروموزوم ۱۱، در Rat کروموزوم ۱۰، در سگ کروموزوم ۵، درگاو کروموزوم ۱۹ ، در اسب بر روی کروموزوم ۱۱ .
ساختمان پروتئین P53 :
در انسان P53 دارای ۳۹۳ اسید آمینه و ۷ دومین (Domain ) می باشد که شامل :
دومین شمارهْ ۱ :
یک دومین N ترمینال اسیدی می باشد که بنام دومین فعال کنندهْ رونویسی یا TAD نام دارد. همچنین به عنوان دومین فعال کننده ۱ (AD1) شناخته می شودکه می تواند فاکتورهای رونویسی را فعال کننده رونویسی را فعال نماید این دومین اسید آمینه های شماره ۱ تا ۴۲ را شامل می شود انتهای N ترمینال شامل دو دومین فعال کننده رونویسی می باشد که مکمل یکدیگر هستند که یکی از آنها بزرگتر و از اسید آمینه ۱ تا ۴۲ بوده و دیگری کوچکتر و از اسید آمینه ۵۵تا ۷۵ می باشد که به طور اختصاصی در تنظیم چند ژن پروآپپتوتیک دخالت دارند.
دومین شمارهْ : ۲
دومین فعال کنندهْ شمارهْ ۲ یا AD2 که نقش مهمی در فعال کردن آپپتوز دارد و از اسید آمینه ۴۳ تا ۶۳ را شامل می شود .
دومین شمارهْ ۳ :
دومین غنی از پرولین که نقش مهمی در فعالیت آپپتوزی مولکول p53 دارد و از اسید آمینه ۶۴ تا ۹۲ را شامل می شود.
دومین شمارهْ۴ :
دومین مرکزی وصل شونده به DNA یا DBD که حاوی یک اتم روی و چند اسید آمینهْ آرژینین می باشد و از اسید آمینه ۱۰۰ تا ۳۰۰ را شامل می شود این ناحیه مسؤل اتصال مولکول LMO3 می باشد که کمک کننده به مهار (کورپرسور) p53 است .
دومین شمارهْ ۵:
دومین سیگنال دهنده هسته ایی که از اسید آمینه شماره ۳۱۶ تا ۳۲۵ را شامل می شود.
دومین شمارهْ ۶ :
دومین اولیگومر کننده(OD) که از اسی آمینه ۳۰۷ تا ۳۵۵ را شامل می شود و ایجاد حالت تترامریزه شدن در مولکول P53 ( 4 رشته ای ) را می کند که برای ایفای نقش آن در داخل بدن بسیار حیاتی است.
دومین شمارهْ ۷ :
دومین C ترمینال که در کاهش اتصال دومین مرکزی متصل شونده به DNA دخالت داردو از اسید های آمینه ۳۵۶ تا ۳۹۳ را شامل می شود.
یک دومین ۹ اسیدآمینه ایی تکراری بنام ۹aaTAD در ناحیه AD1 و AD2 مولکول p53 شناسایی شده است این دومین واسطه واکنش بین مولکول p53 و تقویت کننده های عمومی فعالیت مولکولی (general co activator) شاملTAF,CBP/p300, GCN5, PC4 و همچنین واسطه بین پروتیین تنظیم کننده(MDM2) و پروتیین عامل تکثیر (Replication protein) می باشد.
جهشهای غیر فعال کنندهْ P53 در Cancer ها معمولا‌َ در دومین BDB صورت می گیرد. در واقع بیشتر جهشها توانایی چسبیدن پروتئین به DNA را از بین می برد و بنابراین باعث مهار اثر فعال کنندگی فاکتورهای رونویسی این مولکول می شود.
این جهشها معمولاُ به شکل اتوزوم مغلوب هستند و از طرفی باعث اتصال مولکول معیوب به مولکول سالم P53 نیز می شوند که این باعث مهار عملکرد مولکولهای سالم P53 در سلول می شود.
عملکرد P53 :
P53 دارای مکانیسمهای ضد سرطانی زیادی می باشد همچنین در آپپتوز، در پایداری ژنوم و جلوگیری از فعالیتهای رگزایی نقش دارد. به عنوان عملکرد ضد سرطانی از مکانیسم های زیر استفاده می کند:
۱ – میتواند پروتئینهای ترمیم کنندهْ DNA را در مواردی کهDNA آسیب دیده تشخیص داده می شود فعال نماید.
۲ –با متوقف کردن چرخهْ سلولی در نقطهْ G1/S مانع رشد سلول شده تا آسیب تشخیص داده شده بر روی DNA ترمیم شود، بعد از ترمیم آسیب ، مهارسلول برداشته می شود و سلول ادامهْ چرخهْ خود را انجام می دهد.
۳ – آپپتوز را میتواند شروع نماید ، آپپتوز مرگ برنامه ریزی شدهْ سلول است در حالتیکه آسیب DNA غیر قابل ترمیم باشد آپپتوز شروع خواهد شد.
مکانیسم عملکرد به این صورت است که :
در حالت طبیعی P53 به مولکول mdm2 متصل بوده و غیر فعال می باشد به محض ایجاد آسیب DNA یا استرسهای سلولی دو حالت اتفاق می افتد.
الف: مهار P53 برداشته می شودو P53 فعال می گردد.
ب: میزان تولید P53 در سلول افزایش می یابد.
P53 فعال شده بهDNA وصل می شودو باعث افزایش بیان چند ژن شامل WAF1/CIP1 می شود که مولکول P21 را کد می کنند.
P21 در فاز G1/S به CDK2 (Cycling Depended Kinas 2) متصل می شود و باعث مهار آن می گردد.
کمپلکس CDK2 برای ادامهْ روند چرخهْ سلولی بسیار مهم می باشد،و وقتی که P21 به آن متصل شد سلول نمی تواند وارد مرحلهْ بعدی تقسیم خود شود .
P53 جهش یافته نمی تواند برای مدت طولانی به DNA وصل شود و در نتیجه P21 نیز به مقدار کافی در دسترس نخواهد بود تا سیگنال توقف تقسیم سلولی را ایجاد نماید، و سلول به صورت غیر قابل کنترل تقسیم خواهد شد و نتیجهْ آن ایجاد تومور خواهد بود. تحقیقات اخیر اتصال مولکول P53 را به مولکول دیگری بنام RB1 از طریق واسطه ای بنام۱۴ P جهت مهار سیکل سلولی نشان داده است.
بیان P53 را میتوان به وسیلهْ قرار دادن سلول در معرض اشعهْ U.V بررسی نمود. در این حالت اشعهْ U.V باعث آسیب DNA شده و مقدار p53 در سلول افزایش می یابد.
تنظیم نمودن مقدار P53 :
P53 میتواند در پاسخ به استرسهای سلولی فعال گردد. این استرسها شامل آسیب DNA به وسیلهْ اشعهْ U.V یا اشعهْ مادون قرمز یا مواد شیمیایی مثل پراکسید هیدروژن میباشد،ویا استرسهای اکسیداتیو مثل هیپوکسی یا شوک اسمزی یا اتمام ذخیرهْ ریبونوکلئوتیدی سلول و یا بیان کنترل نشدهْ اونکوژنهای سلول ( ژنهای سرطان زایی سلول) . این فعال شدن به وسیلهْ دو اتفاق عمده مشخص می شود:
الف: نیمه عمر مولکول P53 افزایش می یابد که منجر به تجمع سریع P53 در سلول استرس دیده، می شود.
ب: تغئیر شکل فضایی که منجر به قویتر شدن P53 در فعال کردن تنظیم کننده های رونویسی در سلول آسیب دیده می شوند.
مهمترین اتفاق در فعال کردن P53 ، فسفریله شدن دومین N ترمینال آن می باشدکه منجر به فعال کردن یکسری از پروتئین کینازها خواهد شد. این پروتئین کینازها به دو گروه تقسیم می شوند:
۱-یک گروه آنهایی هستند که متعلق به خانواده NAPK مثل (JNK1-3 و ERK1-2 وP38MAPK) می باشند که در تعدادی از انواع استرسهای سلولی مثل آسیب غشاء سلولی ، آسیبهای اکسیداتیو ، شوک اسمزی ، شوکهای حرارتی و….. فعالیت می کنند.
۲-گروه دوم پروتئین کینازها شامل (ATM،ATR،CHK1،CHK2،DNA-PK،CAK)
می باشند که در یکنواختی و اتصال ژنوم دخالت دارندو به صورت یک آبشار مولکولی در آسیب های DNA که بوسیلهْ مواد ژنوتوکسیک ایجاد می شود فعالیت می نمایند.انکوژنها نیز P53 را با واسطهْ پروتئین P14 فعال می نمایند. در سلولی که تحت استرس نباشد مقدارP53 به وسیلهْ تخریب پیوستهْ آن پائین نگه داشته می شود. یک پروتئینی بنام mdm2 که در انسان HDM2 نیز نامیده می شودکه خود از P53 تولید می شود به مولکول P53 متصل می شود واز فعالیت آن و همچنین از حرکت آن از هسته به سیتوپلاسم جلوگیری می کند. همچنین mdm2 باعث فعال شدن یو بی کو ای تین لیگاز می شود که یو بی کو ای تین را به صورت پیوند کووالان به مولکول P53 متصل کرده و باعث تخریب آن در مجموعهْ پروتئازوم می شود. یو بی کوای تیلیشن P53 برگشت پذیر می باشد.
یک پروتئاز اختصاصی بنام USP7 میتواند پیوند یوبی کوای تین و p53 را بشکند که این باعث افزایش مقدار p53 در سلول خواهد شد. این حالت در پاسخ به اونکوژنهای سلولی صورت می گیرد.
Mdm2 باعث می شود قسمت فسفریله شدهْ N ترمینال P53 که منجر به فعال شدن این مولکول شده بود را فسفریله کند. مولکولهایی مثل Pin1 منجر به تغییر شکل فضایی مولکول P53 می شوند و عملکرد mdm2 را مهار می کنند.
فسفریلاسیون همچنین اجازهْ اتصال به فعال کننده های رونویسی مانند(P300 ویا PCAF) را میدهد که اینها منجر به ا ستیله شدن ناحیهْ کربوکسی مولکول P53 می شوند و این مولکول به این ترتیب خواهد توانست به DNA بچسبد. این اتصال اجازه خواهد داد ژنهایی به طور اختصاصی فعال یا غیر فعال شوند. آنزیم های داستیلاز مانند Sirt1 و Sirt7 که میتوانند P53 را داستیله کنند منجر به مهار آپپتوز خواهند شد. بعضی از اونکوژنها با تحریک رونویسی پروتئینهایی که به mdm2 متصل می شوند منجر به مهار آن شده و مانع آپپتوز خواهند شد.
توضیحاتی در مورد آپپتوز :
سلولها در مقابل عوامل محیطی یا داخلی که منجر به از دست دادن بعضی از تواناییهای حیاتی خود مثل تکثیر یا مصرف انرژی ، تولید ATP یا اتمام بعضی از مواد حیاتی محیطی مانند اکسیژن ، نوکلئوتیدهایی که برای رونویسی از DNA لازم است، دارای مکانیسم از پیش تعریف شده ای هستند که حاصل آن مکانیسم مرگ سلول خواهد بود. در این خصوص برنامهْ از پیش تعیین شده ای برای مردن سلول وجود دارد که طی این برنامه در سلول واکنشهای آبشاری تخریبی فعال میشوند. این واکنشها با تخریب میتوکندری و لیزوزومها که آنزیم های هضم سلولی در آنها قرار دارد شروع می شود،حاصل آن هضم سلول و تجزیه شدن اجزای مختلف آن خواهد بود که به این حالت مرگ از پیش تعیین شدهْ سلولی می گویند. باید توجه داشت آپپتوز با نکروز فرق دارد چون نکروز پروسهْ التهابی و غیر طبیعی است در حالیکه آپپتوز طبیعی است و لازمهْ حیات صحیح یک سلول می باشد.
نقش P53 در بروز بیماریها :
اگر ژن TP53 آسیب ببیند سرکوب کردن تومورها بشدت کاهش خواهد یافت. افرادیکه فقط یک ژن سالم و فعال TP53 را به ارث برده اند در اوایل بلوغ،تومور خواهند گرفت. همهْ ژنها دو کپی دارند: یکی مادری و یکی پدری . ژنهایی که بصورت اتوزوم مغلوب به ارث می رسند فعالیت یک کپی از آنها برای عملکرد صحیح سلول کافی است و چنانچه هردو کپی از ژن معیوب باشد بیماری بروز خواهد کرد. ژنهای سرکوبگر تومور و تولید کنندهْ آنزیم های مختلف از این دسته اند. بعضی از ژنها که نحوهْ وراثت آنها به صورت اتوزوم غالب می باشد مانند انکوژنها ، اشکال در یک کپی از ژن منجر به بروز بیماری مربوطه خواهد شد. توضیح اینکه اکثر این ژنها پروتئینهای ساختمانی سلول را می سازند.
یک بیماری شناخته شده در این خصوص وجود دارد که سندرم لی فرامنی نام دارد. ژن P53 می تواند در سلول به وسیلهْ عوامل ایجاد کنندهْ جهش (موتاژن) مانند : مواد شیمیایی ، اشعه یا ویروسها آسیب ببیند در اینصورت احتمال تقسیمات کنترل نشدهْ سلولی افزایش می یابد. بیشتر از ۵۰% تومورهای انسانی حاوی جهش یا حذف ژن TP53 هستند. افزایش مقدار P53 بنظر می رسد یک راه خوبی برای درمان تومور یا جلوگیری از گسترش آن باشد، اما در عمل هنوز این روش درمانی استفاده نشده است . زیرا این کار می تواند ایجاد پیری زودرس نماید.
به هر حال بازگشت ذخیرهْ داخل سلولی P53 فعال، امیدهای زیادی را به خود جلب کرده است.
از دست دادن P53 منجر به ناپایداری ژنوم می شود و اغلب در حالتهای آنیوپلوئیدی Aneuploidy)) ( تغییر تعداد کروموزومها ) . بعضی پاتوژنها می توانند بر روی پروتئین P53 تآثیر داشته باشند این کار از طریق تآثیر بر روی بیان TP53 صورت میگیرد. یک مثال در این زمینه پاپیلوما ویروس انسانی(HPV) می باشد که پروتئینی بنام E6 را کد می کند که این پروتئین می تواند به P53 متصل شود و آنرا غیر فعال نماید.
این پروتئین در همکاری با پروتئین دیگری بنام PRB یا پروتئین E7 که توسط EBV تولید می شود اجازه می دهد تقسیمات مکرر سلولی اتفاق افتاده و بیماری کلینیکی زگیل به وجود بیاید.
بعضی از انواع HPV مانند Type 16,18 میتوانند باعث پیشرفت زگیل به وجود آمده شده و فرمهایی از دیسپلازی سرویکس (دهانهْ رحم) را ایجاد کنند که نوعی از آسیبهای پیش سرطانی این ناحیه می باشد. عفونتهای مقاوم سرویکس (دهانهْ رحم ) در طول سالها می تواند ایجاد آسیبهای برگشت ناپذیر و کارسینوم آن ناحیه را ایجاد کند، که در نهایت سرطان مهاجم سرویکس را باعث خواهد شد، این نتیجهْ اثرات ژنهای HPV به ویژه آنهایی که کد کنندهْ E6 و E7 هستند میباشد. این دو پروتئین انکو پروتئینهای ویروسی می باشند که در نتیجهْ اتصال DNA ویروسی به DNA ژنومیک سلول میزبان به وجود می آیند. در انسان سالم پروتئین P53 دائمآ تولید و تخریب می شود. تخریب P53 همانطور که ذکر شد ارتباط با اتصال به mdm2 دارد.
در یک چرخهْ فیدبک منفی mdm2 خودش نیز به وسیلهْ پروتئین P53 القاء می شود. پروتئینهای P53 جهش یافته منجر به القاء mdm2 نخواهد شد و آنها در مقادیر زیادی در سلول تجمع پیدا خواهند کرد. بدتر از همه اینکه پروتئین جهش یافتهْ P53 میتواند عملکرد نرمال P53 را مهار کند.
کشف P53 :
P53 در سال ۱۹۷۹ به وسیلهْ Lionel Crawford و همکاران که در دانشگاه پرینستون انگلیس بر روی تومورهای تجربی کار می کردند کشف شد. فرضیهْ وجود چنین ژنی از تآثیر ویروس SV40 در ایجاد و توسعهْ تومور از قبل وجود داشت .
ژن TP53 موشی در سال ۱۹۸۲ توسط Peter Chamakov که از دانشمندان روسی بود کلون گردید. ژن TP53 انسانی در سال ۱۹۸۴ کلون گردید. در سال ۱۹۹۲ ، Wafik-Eldeiry یک توالی مورد توافق( (consensus sequenceدر ژن P53 انسانی پیدا نمود که در واکنش ایمنو پرسیپیتاسیون ژنوم انسان و پروتئینهای P53 تولید شده توسط باکلو ویروس(Baculo virus) (نوعی ویروس حشرات ) قابل شناسایی بود. این کشف در اولین شمارهْ ژورنال Nature Genetics در سال ۱۹۹۲ چاپ گردید ، و نتیجه گیری شد که این توالی ناحیهْ کنترل شدهْ ژن P53 میباشد. در سال ۱۹۹۳ این مولکول ، نام مولکول سال را به خود گرفت .
واکنش متقابل :
P53 در سلول با ژنهای دیگری مانند ATM: (Ataxia Telangiectasia Mutated) و BRCA1و BRCA2 (Breast Cancer Ag 1,2) و cdk1 و cyclin H و CREB1 و Heat shock protein ۹۰ کیلودالتونی سیتوزولی و بسیاری ژنهای دیگر واکنش متقابل دارد.
روشهای شناسایی پروتیین p53:
جهت شناسایی پروتیین p53 از تکنیک های ایمنولوژی با استفاده از آنتی بادی منوکلونال ضد مولکول p53 کمک گرفته می شود این مولکول برای گونه های دیگر بسیا آنتی ژنیک بوده و از این خاصیت آن جهت تهیه آنتی بادی برعلیه آن استفاده می شود و به این وسیله قابل شناسایی است ازآنجا که افزایش p53 در سلولها صورت می گیرد بنابراین جهت بررسی افزایش بیان بافتی از تکنیک ایمنوهیستوشیمی بااستفاده از منوکلونال آنتی بادی کمک می گیرند.
شناسایی جهش های ژنی p53 :
همانطور که در متن اشاره گردید در بسیاری از سرطان ها بوجود آمدن جهش در ژن p53 عامل پشیرفت سرطان می باشد بنابراین برای شناسایی این جهش ها از تکنیک های مولکولی مثل PCR با استفاده از پرایمر مخصوص این ژن و مقایسه آن با ژن طبیعی کمک گرفته می شود
منابع:
۱- Piskacek S, Gregor M, Nemethova M, Grabner M, Kovarik P, Piskacek M (June 2007). “Nine-amino-acid transactivation domain: establishment and prediction utilities”. Genomics 89 (6): 756–۶۸
۲- Cui R, Widlund HR, Feige E, Lin JY, Wilensky DL, Igras VE, D’Orazio J, Fung CY, Schanbacher CF, Granter SR, Fisher DE (2007). “Central role of p53 in the suntan response and pathologic hyperpigmentation”. Cell 128 (5): 853–۶۴٫
۳- Vakhrusheva O, Smolka C, Gajawada P, Kostin S, Boettger T, Kubin T, Braun T, Bober (March 2008). “Sirt7 increases stress resistance of cardiomyocytes and prevents apoptosis and inflammatory cardiomyopathy in mice”. Circ. Res. 102 (6): 703–۱
الف: نگهبان دروازه سلولی (Gate keeper ):
اینها برروی سیکل سلولی عملکرد دارند و چنانچه سلول هنگام تقسیم سلولی دچار مشکل شود وارد عمل شده و از ورود سلول به مرحله بعدی تقسیم جلوگیری می کنند چنانچه مشکل به وجود آمده قابل برطرف شدن باشد تقسیم سلول تا برطرف شدن آن متوقف می شود و چنانچه مشکل قابل حل نباشد سلول موتاسیون پیدا کرده محکوم به فنا است . بنابراین از به وجود آمدن سلول سرطانی و موتاسیون یافته در سیکل سلولی جلوگیری خواهد شد.
ب: Tumor suppressor ها :
یا پروتئینهای سرکوبگر که نقش حفاظتی و ترمیمی ژنوم را به عهده دارند در هنگام همانند سازی از روی DNA چنانچه موتاسیونی اتفاق بیفتد وارد عمل می شوند و باز تا برطرف شدن نقص به وجود آمده کلیه فعالیتهای همانند سازی متوقف می شود.
سیکل سلولی شامل مراحلی است که سلول در آن آمادگی پیدا می کند تا تقسیم انجام دهد این تقسیم می تواند میتوز یا میوز باشد. لازمه تقسیم در سلول ورود به مراحل مختلف است سلول در حالت استراحت در فاز G1 به سر می برد. هنگامیکه می خواهد تقسیم انجام شود از فاز G1 وارد فاز S می شود ، در فاز S همانند سازی کلیهْ مواد حیاتی سلول صورت می گیرد سپس سلول وارد فاز G2 می شود در این فاز یک استراحت کوتاهی انجام می شود و همانند سازی بعضی ازپروتئین های مورد نیاز سلول انجام می شودسپس سلول وارد فاز M یا تقسیم می شود.
سلولهایی که به هیچ وجه تقسیم نمی شوند وارد فاز G0 می شوند مثل سلولهای عصبی . بیشترین زمان را سلول در فاز G1 بسر می برد.
مرحله ورود به هر فاز از سیکل سلولی مرحله بسیار مهمی است. و باید سلول مورد ارزیابی ژنومیک قرار بگیرد به نقاط ورود به هر فاز نقاط Check point گفته می شوند، که این چک کردن به عهدهْGate keeper ها است و بین این فازها تومور سابرسورها فعال هستند.
ژن P53: در انسان P53 توسط ژن TP53 که بر روی بازوی کوچک کروموزوم ۱۷ قرار دارد کد می شود طول ژن ۲۰ هزار جفت باز می باشد که اگزون شمارهْ ۱ آن کد کننده نبوده و اولین اینترون نیز بسیار طویل و ۱۰ هزار جفت باز طول دارد. توالی کد کننده شامل ۵ ناحیه می باشد که اگزونهای ۲ ،۵،۶،۷،۸ این ژن به شدت در بین گونه های مهره داران حفاظت شده می باشد،یعنی دارای توالی ثابت است.
در انسان یک پلی مورفیسم شایع (تغییر توالی شایع) که منجر به جایگزینی آرژینین به جای پرولین در کدون ۷۲ این مولکول می شودوجود دارد. مطالعات زیادی بر روی اثر این تغییر توالی صورت گرفته که نشان می دهد فرد مستعد بروز بعضی از Cancer ها است. محل این ژن در سایر پستانداران بر روی کروموزومهای متفاوتی است برای مثال:در شامپانزه و اوران گوتان بر روی کروموزوم ۱۷، در موش کروموزوم ۱۱، در Rat کروموزوم ۱۰، در سگ کروموزوم ۵، درگاو کروموزوم ۱۹ ، در اسب بر روی کروموزوم ۱۱ .
ساختمان پروتئین P53 :
در انسان P53 دارای ۳۹۳ اسید آمینه و ۷ دومین (Domain ) می باشد که شامل :
دومین شمارهْ ۱ :
یک دومین N ترمینال اسیدی می باشد که بنام دومین فعال کنندهْ رونویسی یا TAD نام دارد. همچنین به عنوان دومین فعال کننده ۱ (AD1) شناخته می شودکه می تواند فاکتورهای رونویسی را فعال کننده رونویسی را فعال نماید این دومین اسید آمینه های شماره ۱ تا ۴۲ را شامل می شود انتهای N ترمینال شامل دو دومین فعال کننده رونویسی می باشد که مکمل یکدیگر هستند که یکی از آنها بزرگتر و از اسید آمینه ۱ تا ۴۲ بوده و دیگری کوچکتر و از اسید آمینه ۵۵تا ۷۵ می باشد که به طور اختصاصی در تنظیم چند ژن پروآپپتوتیک دخالت دارند.
دومین شمارهْ : ۲
دومین فعال کنندهْ شمارهْ ۲ یا AD2 که نقش مهمی در فعال کردن آپپتوز دارد و از اسید آمینه ۴۳ تا ۶۳ را شامل می شود .
دومین شمارهْ ۳ :
دومین غنی از پرولین که نقش مهمی در فعالیت آپپتوزی مولکول p53 دارد و از اسید آمینه ۶۴ تا ۹۲ را شامل می شود.
دومین شمارهْ۴ :
دومین مرکزی وصل شونده به DNA یا DBD که حاوی یک اتم روی و چند اسید آمینهْ آرژینین می باشد و از اسید آمینه ۱۰۰ تا ۳۰۰ را شامل می شود این ناحیه مسؤل اتصال مولکول LMO3 می باشد که کمک کننده به مهار (کورپرسور) p53 است .
دومین شمارهْ ۵:
دومین سیگنال دهنده هسته ایی که از اسید آمینه شماره ۳۱۶ تا ۳۲۵ را شامل می شود.
دومین شمارهْ ۶ :
دومین اولیگومر کننده(OD) که از اسی آمینه ۳۰۷ تا ۳۵۵ را شامل می شود و ایجاد حالت تترامریزه شدن در مولکول P53 ( 4 رشته ای ) را می کند که برای ایفای نقش آن در داخل بدن بسیار حیاتی است.
دومین شمارهْ ۷ :
دومین C ترمینال که در کاهش اتصال دومین مرکزی متصل شونده به DNA دخالت داردو از اسید های آمینه ۳۵۶ تا ۳۹۳ را شامل می شود.
یک دومین ۹ اسیدآمینه ایی تکراری بنام ۹aaTAD در ناحیه AD1 و AD2 مولکول p53 شناسایی شده است این دومین واسطه واکنش بین مولکول p53 و تقویت کننده های عمومی فعالیت مولکولی (general co activator) شاملTAF,CBP/p300, GCN5, PC4 و همچنین واسطه بین پروتیین تنظیم کننده(MDM2) و پروتیین عامل تکثیر (Replication protein) می باشد.
جهشهای غیر فعال کنندهْ P53 در Cancer ها معمولا‌َ در دومین BDB صورت می گیرد. در واقع بیشتر جهشها توانایی چسبیدن پروتئین به DNA را از بین می برد و بنابراین باعث مهار اثر فعال کنندگی فاکتورهای رونویسی این مولکول می شود.
این جهشها معمولاُ به شکل اتوزوم مغلوب هستند و از طرفی باعث اتصال مولکول معیوب به مولکول سالم P53 نیز می شوند که این باعث مهار عملکرد مولکولهای سالم P53 در سلول می شود.
عملکرد P53 :
P53 دارای مکانیسمهای ضد سرطانی زیادی می باشد همچنین در آپپتوز، در پایداری ژنوم و جلوگیری از فعالیتهای رگزایی نقش دارد. به عنوان عملکرد ضد سرطانی از مکانیسم های زیر استفاده می کند:
۱ – میتواند پروتئینهای ترمیم کنندهْ DNA را در مواردی کهDNA آسیب دیده تشخیص داده می شود فعال نماید.
۲ –با متوقف کردن چرخهْ سلولی در نقطهْ G1/S مانع رشد سلول شده تا آسیب تشخیص داده شده بر روی DNA ترمیم شود، بعد از ترمیم آسیب ، مهارسلول برداشته می شود و سلول ادامهْ چرخهْ خود را انجام می دهد.
۳ – آپپتوز را میتواند شروع نماید ، آپپتوز مرگ برنامه ریزی شدهْ سلول است در حالتیکه آسیب DNA غیر قابل ترمیم باشد آپپتوز شروع خواهد شد.
مکانیسم عملکرد به این صورت است که :
در حالت طبیعی P53 به مولکول mdm2 متصل بوده و غیر فعال می باشد به محض ایجاد آسیب DNA یا استرسهای سلولی دو حالت اتفاق می افتد.
الف: مهار P53 برداشته می شودو P53 فعال می گردد.
ب: میزان تولید P53 در سلول افزایش می یابد.
P53 فعال شده بهDNA وصل می شودو باعث افزایش بیان چند ژن شامل WAF1/CIP1 می شود که مولکول P21 را کد می کنند.
P21 در فاز G1/S به CDK2 (Cycling Depended Kinas 2) متصل می شود و باعث مهار آن می گردد.
کمپلکس CDK2 برای ادامهْ روند چرخهْ سلولی بسیار مهم می باشد،و وقتی که P21 به آن متصل شد سلول نمی تواند وارد مرحلهْ بعدی تقسیم خود شود .
P53 جهش یافته نمی تواند برای مدت طولانی به DNA وصل شود و در نتیجه P21 نیز به مقدار کافی در دسترس نخواهد بود تا سیگنال توقف تقسیم سلولی را ایجاد نماید، و سلول به صورت غیر قابل کنترل تقسیم خواهد شد و نتیجهْ آن ایجاد تومور خواهد بود. تحقیقات اخیر اتصال مولکول P53 را به مولکول دیگری بنام RB1 از طریق واسطه ای بنام۱۴ P جهت مهار سیکل سلولی نشان داده است.
بیان P53 را میتوان به وسیلهْ قرار دادن سلول در معرض اشعهْ U.V بررسی نمود. در این حالت اشعهْ U.V باعث آسیب DNA شده و مقدار p53 در سلول افزایش می یابد.
تنظیم نمودن مقدار P53 :
P53 میتواند در پاسخ به استرسهای سلولی فعال گردد. این استرسها شامل آسیب DNA به وسیلهْ اشعهْ U.V یا اشعهْ مادون قرمز یا مواد شیمیایی مثل پراکسید هیدروژن میباشد،ویا استرسهای اکسیداتیو مثل هیپوکسی یا شوک اسمزی یا اتمام ذخیرهْ ریبونوکلئوتیدی سلول و یا بیان کنترل نشدهْ اونکوژنهای سلول ( ژنهای سرطان زایی سلول) . این فعال شدن به وسیلهْ دو اتفاق عمده مشخص می شود:
الف: نیمه عمر مولکول P53 افزایش می یابد که منجر به تجمع سریع P53 در سلول استرس دیده، می شود.
ب: تغئیر شکل فضایی که منجر به قویتر شدن P53 در فعال کردن تنظیم کننده های رونویسی در سلول آسیب دیده می شوند.
مهمترین اتفاق در فعال کردن P53 ، فسفریله شدن دومین N ترمینال آن می باشدکه منجر به فعال کردن یکسری از پروتئین کینازها خواهد شد. این پروتئین کینازها به دو گروه تقسیم می شوند:
۱-یک گروه آنهایی هستند که متعلق به خانواده NAPK مثل (JNK1-3 و ERK1-2 وP38MAPK) می باشند که در تعدادی از انواع استرسهای سلولی مثل آسیب غشاء سلولی ، آسیبهای اکسیداتیو ، شوک اسمزی ، شوکهای حرارتی و….. فعالیت می کنند.
۲-گروه دوم پروتئین کینازها شامل (ATM،ATR،CHK1،CHK2،DNA-PK،CAK)
می باشند که در یکنواختی و اتصال ژنوم دخالت دارندو به صورت یک آبشار مولکولی در آسیب های DNA که بوسیلهْ مواد ژنوتوکسیک ایجاد می شود فعالیت می نمایند.انکوژنها نیز P53 را با واسطهْ پروتئین P14 فعال می نمایند. در سلولی که تحت استرس نباشد مقدارP53 به وسیلهْ تخریب پیوستهْ آن پائین نگه داشته می شود. یک پروتئینی بنام mdm2 که در انسان HDM2 نیز نامیده می شودکه خود از P53 تولید می شود به مولکول P53 متصل می شود واز فعالیت آن و همچنین از حرکت آن از هسته به سیتوپلاسم جلوگیری می کند. همچنین mdm2 باعث فعال شدن یو بی کو ای تین لیگاز می شود که یو بی کو ای تین را به صورت پیوند کووالان به مولکول P53 متصل کرده و باعث تخریب آن در مجموعهْ پروتئازوم می شود. یو بی کوای تیلیشن P53 برگشت پذیر می باشد.
یک پروتئاز اختصاصی بنام USP7 میتواند پیوند یوبی کوای تین و p53 را بشکند که این باعث افزایش مقدار p53 در سلول خواهد شد. این حالت در پاسخ به اونکوژنهای سلولی صورت می گیرد.
Mdm2 باعث می شود قسمت فسفریله شدهْ N ترمینال P53 که منجر به فعال شدن این مولکول شده بود را فسفریله کند. مولکولهایی مثل Pin1 منجر به تغییر شکل فضایی مولکول P53 می شوند و عملکرد mdm2 را مهار می کنند.
فسفریلاسیون همچنین اجازهْ اتصال به فعال کننده های رونویسی مانند(P300 ویا PCAF) را میدهد که اینها منجر به ا ستیله شدن ناحیهْ کربوکسی مولکول P53 می شوند و این مولکول به این ترتیب خواهد توانست به DNA بچسبد. این اتصال اجازه خواهد داد ژنهایی به طور اختصاصی فعال یا غیر فعال شوند. آنزیم های داستیلاز مانند Sirt1 و Sirt7 که میتوانند P53 را داستیله کنند منجر به مهار آپپتوز خواهند شد. بعضی از اونکوژنها با تحریک رونویسی پروتئینهایی که به mdm2 متصل می شوند منجر به مهار آن شده و مانع آپپتوز خواهند شد.
توضیحاتی در مورد آپپتوز :
سلولها در مقابل عوامل محیطی یا داخلی که منجر به از دست دادن بعضی از تواناییهای حیاتی خود مثل تکثیر یا مصرف انرژی ، تولید ATP یا اتمام بعضی از مواد حیاتی محیطی مانند اکسیژن ، نوکلئوتیدهایی که برای رونویسی از DNA لازم است، دارای مکانیسم از پیش تعریف شده ای هستند که حاصل آن مکانیسم مرگ سلول خواهد بود. در این خصوص برنامهْ از پیش تعیین شده ای برای مردن سلول وجود دارد که طی این برنامه در سلول واکنشهای آبشاری تخریبی فعال میشوند. این واکنشها با تخریب میتوکندری و لیزوزومها که آنزیم های هضم سلولی در آنها قرار دارد شروع می شود،حاصل آن هضم سلول و تجزیه شدن اجزای مختلف آن خواهد بود که به این حالت مرگ از پیش تعیین شدهْ سلولی می گویند. باید توجه داشت آپپتوز با نکروز فرق دارد چون نکروز پروسهْ التهابی و غیر طبیعی است در حالیکه آپپتوز طبیعی است و لازمهْ حیات صحیح یک سلول می باشد.
نقش P53 در بروز بیماریها :
اگر ژن TP53 آسیب ببیند سرکوب کردن تومورها بشدت کاهش خواهد یافت. افرادیکه فقط یک ژن سالم و فعال TP53 را به ارث برده اند در اوایل بلوغ،تومور خواهند گرفت. همهْ ژنها دو کپی دارند: یکی مادری و یکی پدری . ژنهایی که بصورت اتوزوم مغلوب به ارث می رسند فعالیت یک کپی از آنها برای عملکرد صحیح سلول کافی است و چنانچه هردو کپی از ژن معیوب باشد بیماری بروز خواهد کرد. ژنهای سرکوبگر تومور و تولید کنندهْ آنزیم های مختلف از این دسته اند. بعضی از ژنها که نحوهْ وراثت آنها به صورت اتوزوم غالب می باشد مانند انکوژنها ، اشکال در یک کپی از ژن منجر به بروز بیماری مربوطه خواهد شد. توضیح اینکه اکثر این ژنها پروتئینهای ساختمانی سلول را می سازند.
یک بیماری شناخته شده در این خصوص وجود دارد که سندرم لی فرامنی نام دارد. ژن P53 می تواند در سلول به وسیلهْ عوامل ایجاد کنندهْ جهش (موتاژن) مانند : مواد شیمیایی ، اشعه یا ویروسها آسیب ببیند در اینصورت احتمال تقسیمات کنترل نشدهْ سلولی افزایش می یابد. بیشتر از ۵۰% تومورهای انسانی حاوی جهش یا حذف ژن TP53 هستند. افزایش مقدار P53 بنظر می رسد یک راه خوبی برای درمان تومور یا جلوگیری از گسترش آن باشد، اما در عمل هنوز این روش درمانی استفاده نشده است . زیرا این کار می تواند ایجاد پیری زودرس نماید.
به هر حال بازگشت ذخیرهْ داخل سلولی P53 فعال، امیدهای زیادی را به خود جلب کرده است.
از دست دادن P53 منجر به ناپایداری ژنوم می شود و اغلب در حالتهای آنیوپلوئیدی Aneuploidy)) ( تغییر تعداد کروموزومها ) . بعضی پاتوژنها می توانند بر روی پروتئین P53 تآثیر داشته باشند این کار از طریق تآثیر بر روی بیان TP53 صورت میگیرد. یک مثال در این زمینه پاپیلوما ویروس انسانی(HPV) می باشد که پروتئینی بنام E6 را کد می کند که این پروتئین می تواند به P53 متصل شود و آنرا غیر فعال نماید.
این پروتئین در همکاری با پروتئین دیگری بنام PRB یا پروتئین E7 که توسط EBV تولید می شود اجازه می دهد تقسیمات مکرر سلولی اتفاق افتاده و بیماری کلینیکی زگیل به وجود بیاید.
بعضی از انواع HPV مانند Type 16,18 میتوانند باعث پیشرفت زگیل به وجود آمده شده و فرمهایی از دیسپلازی سرویکس (دهانهْ رحم) را ایجاد کنند که نوعی از آسیبهای پیش سرطانی این ناحیه می باشد. عفونتهای مقاوم سرویکس (دهانهْ رحم ) در طول سالها می تواند ایجاد آسیبهای برگشت ناپذیر و کارسینوم آن ناحیه را ایجاد کند، که در نهایت سرطان مهاجم سرویکس را باعث خواهد شد، این نتیجهْ اثرات ژنهای HPV به ویژه آنهایی که کد کنندهْ E6 و E7 هستند میباشد. این دو پروتئین انکو پروتئینهای ویروسی می باشند که در نتیجهْ اتصال DNA ویروسی به DNA ژنومیک سلول میزبان به وجود می آیند. در انسان سالم پروتئین P53 دائمآ تولید و تخریب می شود. تخریب P53 همانطور که ذکر شد ارتباط با اتصال به mdm2 دارد.
در یک چرخهْ فیدبک منفی mdm2 خودش نیز به وسیلهْ پروتئین P53 القاء می شود. پروتئینهای P53 جهش یافته منجر به القاء mdm2 نخواهد شد و آنها در مقادیر زیادی در سلول تجمع پیدا خواهند کرد. بدتر از همه اینکه پروتئین جهش یافتهْ P53 میتواند عملکرد نرمال P53 را مهار کند.
کشف P53 :
P53 در سال ۱۹۷۹ به وسیلهْ Lionel Crawford و همکاران که در دانشگاه پرینستون انگلیس بر روی تومورهای تجربی کار می کردند کشف شد. فرضیهْ وجود چنین ژنی از تآثیر ویروس SV40 در ایجاد و توسعهْ تومور از قبل وجود داشت .
ژن TP53 موشی در سال ۱۹۸۲ توسط Peter Chamakov که از دانشمندان روسی بود کلون گردید. ژن TP53 انسانی در سال ۱۹۸۴ کلون گردید. در سال ۱۹۹۲ ، Wafik-Eldeiry یک توالی مورد توافق( (consensus sequenceدر ژن P53 انسانی پیدا نمود که در واکنش ایمنو پرسیپیتاسیون ژنوم انسان و پروتئینهای P53 تولید شده توسط باکلو ویروس(Baculo virus) (نوعی ویروس حشرات ) قابل شناسایی بود. این کشف در اولین شمارهْ ژورنال Nature Genetics در سال ۱۹۹۲ چاپ گردید ، و نتیجه گیری شد که این توالی ناحیهْ کنترل شدهْ ژن P53 میباشد. در سال ۱۹۹۳ این مولکول ، نام مولکول سال را به خود گرفت .
واکنش متقابل :
P53 در سلول با ژنهای دیگری مانند ATM: (Ataxia Telangiectasia Mutated) و BRCA1و BRCA2 (Breast Cancer Ag 1,2) و cdk1 و cyclin H و CREB1 و Heat shock protein ۹۰ کیلودالتونی سیتوزولی و بسیاری ژنهای دیگر واکنش متقابل دارد.
روشهای شناسایی پروتیین p53:
جهت شناسایی پروتیین p53 از تکنیک های ایمنولوژی با استفاده از آنتی بادی منوکلونال ضد مولکول p53 کمک گرفته می شود این مولکول برای گونه های دیگر بسیا آنتی ژنیک بوده و از این خاصیت آن جهت تهیه آنتی بادی برعلیه آن استفاده می شود و به این وسیله قابل شناسایی است ازآنجا که افزایش p53 در سلولها صورت می گیرد بنابراین جهت بررسی افزایش بیان بافتی از تکنیک ایمنوهیستوشیمی بااستفاده از منوکلونال آنتی بادی کمک می گیرند.
شناسایی جهش های ژنی p53 :
همانطور که در متن اشاره گردید در بسیاری از سرطان ها بوجود آمدن جهش در ژن p53 عامل پشیرفت سرطان می باشد بنابراین برای شناسایی این جهش ها از تکنیک های مولکولی مثل PCR با استفاده از پرایمر مخصوص این ژن و مقایسه آن با ژن طبیعی کمک گرفته می شود
منابع:
۱- Piskacek S, Gregor M, Nemethova M, Grabner M, Kovarik P, Piskacek M (June 2007). “Nine-amino-acid transactivation domain: establishment and prediction utilities”. Genomics 89 (6): 756–۶۸
۲- Cui R, Widlund HR, Feige E, Lin JY, Wilensky DL, Igras VE, D’Orazio J, Fung CY, Schanbacher CF, Granter SR, Fisher DE (2007). “Central role of p53 in the suntan response and pathologic hyperpigmentation”. Cell 128 (5): 853–۶۴٫
۳- Vakhrusheva O, Smolka C, Gajawada P, Kostin S, Boettger T, Kubin T, Braun T, Bober (March 2008). “Sirt7 increases stress resistance of cardiomyocytes and prevents apoptosis and inflammatory cardiomyopathy in mice”. Circ. Res. 102 (6): 703–۱