سید لفته فردزاده
4th August 2015, 10:02 AM
در مدت زمان نسبتأ کوتاهی که از کشف نحوه تولید آنتی بادیهای منوکلونال می گذرد، این آنتی بادیها ارزش غیر قابل انکاری در زمینه های تشخیصی و اندازه گیری مواد هم در بدن موجود زنده و نیز در زمینه های (in-vitro) و هم در آزمایشگاه (in-vivo) درمانی یافته اند. قدرت آنتی بادیهای منوکلونال در شناسایی تنها یک آنتی ژن در محیط های حاوی آنتی ژنهای متعدد می باشد و بدین لحاظ به جرأت می توان گفت که این آنتی بادیهای یکه تاز عرصه تشخیص های ایمونولژیک و ایمنوتراپی هستند. در این مبحث و در شماره های پیاپی سعی می شود تا به استفاده های رایج تشخیصی و درمانی آنتی بادیهای منوکلونال به اختصار پرداخته شود
1) استفاده های تشخیصی:
الف) ایمنواسی ها (Immunoassays)
به تستهایی که در آنها ماده ای در مایع تحت آزمایش با استفاده از آنتی بادیهای نشا ندار شده ردیابی و یا اندازه گیری شود ایمنواسی می گویند. در ابتدا از آنتی بادیهای پلی کلونال در تستهای ایمونو اسی استفاده می شد و بنابراین قدمت این تستها به قبل از پیدایش آنتی بادیهای منوکلونال برمی گردد. ولی در حال حاضر در اکثر ایمنواسی ها از آنت ی بادیهای منوکلونال استفاده می شود. آنتی بادیهای منوکلونال به علت داشتن خصوصیاتی چون قابلیت تولید یک آنتی بادی کاملاً یکسان در مقادیر نامحدود، اختصاصیت زیاد، قابلیت خالص سازی برای کاهش اتصال زمینه ای و تولید آن در پاسخ به آنتی ژن ناخالص بسیار مورد توجه قرار گرفت ه اند. ایمنو اسی ها بطور کلی و بنابر نوع ماده نشاندار کننده و نوع طراحی تست از جهت ،(RIA) شناسایی همزمان یک یا چند اپیتوپ به رادیوایمونواسی (ELISA) Enzyme و الایزا (IRMA) ایمنورادیومتریک اسی تقسیم می شوند. اگر چه Linked ImmunoSorbant Assay هنوز هم بسیاری از ا یمنواسی ها با استفاده از آنتی بادیهای پلی کلونال صورت می گیرند ولی در موارد خاص بدون وجود آنتی بادیهای منوکلونال امکان طراحی تستهای تشخیصی و تحقیقاتی وجود نخواهد داشت. می توان بطور عام گفت که با استفاده از آنتی بادی منوکلونال تمایل کاهش می یابد ولی (Affinity) برای اتصال به آنتی ژن اختصاصیت افزایش می یابد. اگر چه در طراحی اکثر ایمنواسی ها تمایل برای اتصال به آنتی ژن مهم است ولی در بسیاری از تستها از جمله تشخیص موادی که ساختمان نزدیک بهم دارند مانند یک دارو و متابولیت های آن و یا ایزوفرم های یک آنزیم، اختصاصیت آنتی بادی شناسایی کننده اهمیت حیاتی دارد و لذا استفاده از آنتی بادیهای منوکلونال در این موارد ضروری است . ایجاد آنتی که برای دو اپیتوپ بر روی یک آنتی ژن bispecific بادیهای اختصاصی هستند . باعث شده است که با افزایش تمایل اتصال و نیز اختصاصیت بالا موارد استفاده گسترده تری برای آنتی بادیهای منوکلونال بوجود آید . نمونه عملی این مورد، طراحی تست تشخیص آزمایشگاهی برای آمبولی ریه است که در آن استفاده از آنتی بادی بر علیه یکی از محصولات تجزیه فیرین bispecific منوکلونال و اضافه کردن این RBC و نیز آنتی ژنهای سطحی (D-dimer) آنتی بادی به خون بیمار مبتلا به آمبولی ریه در لوله آزمایش سبب تجمع گلبولهای قرمز می گردد و بدین ترتیب تست آزمایشگاهی مناسبی و در عین حال سریعی را می توان برای تشخیص سریع آمبولی ریه طراحی نمود. به ترتیب مشابه، از آنتی بادیهای منوکلونال در ایمنواسی ها برای ردیابی بسیاری از هورمونها، متابولیت ها، تومورمارکرها، داروها و مواد مخدر و میکروارگانیسم ها استفاده می شود.
ب) ایمنوسیتوشیمی:
با استفاده از روش ایمنوسیتوشیمی می توان محل آنتی ژنهای مختلف در داخل سلولها، سطح سلولها و یا در بافت را بوسیله آنتی بادیهای نشان دار شده ( چه مستقیمأ و چه از طریق یک آنتی بادی ثانویه نشاندار شده ) و مطالعه توسط میکروسکوپ تشخیص داد. این روش خصوصأ در کنار مطالعه معمول پاتولوژیک بافت، اطلاعات ارزشمندی از نحوه پراکندگی سلولهای حامل یک آنتی ژن خاص بدست می دهد و می توان از آن در تمایز انواع مختلف سلولهای توموری، ارگانسیم های عفونی و سلولهای التهابی در یک بافت خاص کمک قابل توجهی گرفت. بطور کلی می توان گفت که در این موارد بکارگیری آنتی بادیهای منوکلونال اختصاصیت بهتری در مقایسه با آنتی بادیهای پلی کلونال دارد ولی در مواردی از جمله از دست رفتن اپی توپ مورد نظر در جریان ثابت کردن (fixation) بافت، آنتی بادیهای منوکلونال ارزش خود را از دست می دهند. بنابراین بهتر است برای شناسایی برخی از آنتی ژنها، خصوصأ در بافت ثابت شده از آنتی بادی پلی کلونال استفاده شود. برای نشاندار کردن آنتی بادی های پلی کلونال در ایمنوسیتوشیمی غالبأ از آنزیم ها و سوبستراهایی که رنگهای نامحلول ایجاد می کنند مانند DAB و آلکالین فسفاتاز و یا از مواد فلئورسانس مانند فلئورسئین یا FITC استفاده می شود.
ج) فلوسیتومتری
در این روش از یک یا چند آنتی بادی نشاندار شده با مواد مولد فلئورسانس که قادر به شناسایی سلولهای مورد نظر هستند برای تعقیب این سلولها توسط دستگاه فلوسیتومتر استفاده می شود. این دستگاه بر طبق داشتن و یا نداشتن فلئورسانس مخلوطی از سلولها را از یکدیگر جدا می کند. این روش خصوصأ در سالهای جدید استفاده های تشخیصی بسیار یافته است. با استفاده از فلوسیتومتری می توان زیر گروههای سلولی را در خون، مغز استخوان و یا مایعات دیگر بدن برحسب آنتی ژن مورد نظر شناسایی کرد و بدین ترتیب موارد افزایش و یا کاهش هر زیر گروه را به دقت ارزیابی نمود. حتی می توان نوع سایتوکاین های ترشحی یک سلول را نیز مشخص نمود. بدیهی است که در این مورد امکان استفاده از آنتی بادی پلی کلونال وجود ندارد و تنها آنتی بادیهای مورد استفاده از نوع منوکلونال هستند.
د) تشخیص in-vivo :
در حال حاضر آنتی بادیهای منوکلونال متعددی برای ردیابی موارد بیماری مانند: انواع تومورها ( سرطان ریه، پروستات، کلون، تخمدان)، بیماری قلبی، التهابات و عفونت در بدن انسان وجود دارد. در اینگونه موارد از آنتی بادی ضد آنتی ژن اختصاصی بافت بیمار که معمولأ تغییر یافته آنتی ژن طبیعی و یا نوعی از آن است که در حالت طبیعی در سطح سلول بیان نمی شود ( میوزین )، استفاده می شود بدین ترتیب که این آنتی بادی را با یک رادیوایزوتوپ نشاندار می کنند و پس از تزریق این آنتی بادی نشاندار شده محل قرارگیری آنرا در بدن ردیابی می کنند.
از این روش برای تعیین محل توده های سرطانی قبل از عمل جراحی و یا برای تعیین محل و شدت تخریب بافت میوکاردپس از انفارکتوس و یا تعیین محل و شدت آمبولی ریه و یا ترومبوزهای وریدی استفاده می شود. مشخص است که در این مورد هم به غیر از آنتی بادیهای منوکلونال انتخاب دیگری قابل استفاده نیست.
2) کاربردهای درمانی
ایده درمان اختصاصی بیماری توسط آنتی بادیها به اوائل قرن بیستم وقتی که پل ارلیخ (Paul Erlich) از آنتی سرم پلی کلونال برای القاء ایمنی غیر فعال استفاده کرد، بر می گردد. ولی به علت اینکه اکثر آنتی بادیهای تولید شده، چه پلی کلونال و چه منوکلونال، با منشاء حیوانی بوده اند و سبب برانگیختن پاسخ ایمنی در انسان می شده اند، استفاده از درمانهای مبتنی بر آنتی بادی منوکلونال، در انسان محدود بوده است؛ ولی عرضه آنتی بادیهای نوترکیب کایمریک و بتازگی، آنتی بادیهای با منشاء انسانی سبب شده است که موارد استفاده آنتی بادیهای منوکلونال در درمان بیماریها گسترش یابد.
1) استفاده های تشخیصی:
الف) ایمنواسی ها (Immunoassays)
به تستهایی که در آنها ماده ای در مایع تحت آزمایش با استفاده از آنتی بادیهای نشا ندار شده ردیابی و یا اندازه گیری شود ایمنواسی می گویند. در ابتدا از آنتی بادیهای پلی کلونال در تستهای ایمونو اسی استفاده می شد و بنابراین قدمت این تستها به قبل از پیدایش آنتی بادیهای منوکلونال برمی گردد. ولی در حال حاضر در اکثر ایمنواسی ها از آنت ی بادیهای منوکلونال استفاده می شود. آنتی بادیهای منوکلونال به علت داشتن خصوصیاتی چون قابلیت تولید یک آنتی بادی کاملاً یکسان در مقادیر نامحدود، اختصاصیت زیاد، قابلیت خالص سازی برای کاهش اتصال زمینه ای و تولید آن در پاسخ به آنتی ژن ناخالص بسیار مورد توجه قرار گرفت ه اند. ایمنو اسی ها بطور کلی و بنابر نوع ماده نشاندار کننده و نوع طراحی تست از جهت ،(RIA) شناسایی همزمان یک یا چند اپیتوپ به رادیوایمونواسی (ELISA) Enzyme و الایزا (IRMA) ایمنورادیومتریک اسی تقسیم می شوند. اگر چه Linked ImmunoSorbant Assay هنوز هم بسیاری از ا یمنواسی ها با استفاده از آنتی بادیهای پلی کلونال صورت می گیرند ولی در موارد خاص بدون وجود آنتی بادیهای منوکلونال امکان طراحی تستهای تشخیصی و تحقیقاتی وجود نخواهد داشت. می توان بطور عام گفت که با استفاده از آنتی بادی منوکلونال تمایل کاهش می یابد ولی (Affinity) برای اتصال به آنتی ژن اختصاصیت افزایش می یابد. اگر چه در طراحی اکثر ایمنواسی ها تمایل برای اتصال به آنتی ژن مهم است ولی در بسیاری از تستها از جمله تشخیص موادی که ساختمان نزدیک بهم دارند مانند یک دارو و متابولیت های آن و یا ایزوفرم های یک آنزیم، اختصاصیت آنتی بادی شناسایی کننده اهمیت حیاتی دارد و لذا استفاده از آنتی بادیهای منوکلونال در این موارد ضروری است . ایجاد آنتی که برای دو اپیتوپ بر روی یک آنتی ژن bispecific بادیهای اختصاصی هستند . باعث شده است که با افزایش تمایل اتصال و نیز اختصاصیت بالا موارد استفاده گسترده تری برای آنتی بادیهای منوکلونال بوجود آید . نمونه عملی این مورد، طراحی تست تشخیص آزمایشگاهی برای آمبولی ریه است که در آن استفاده از آنتی بادی بر علیه یکی از محصولات تجزیه فیرین bispecific منوکلونال و اضافه کردن این RBC و نیز آنتی ژنهای سطحی (D-dimer) آنتی بادی به خون بیمار مبتلا به آمبولی ریه در لوله آزمایش سبب تجمع گلبولهای قرمز می گردد و بدین ترتیب تست آزمایشگاهی مناسبی و در عین حال سریعی را می توان برای تشخیص سریع آمبولی ریه طراحی نمود. به ترتیب مشابه، از آنتی بادیهای منوکلونال در ایمنواسی ها برای ردیابی بسیاری از هورمونها، متابولیت ها، تومورمارکرها، داروها و مواد مخدر و میکروارگانیسم ها استفاده می شود.
ب) ایمنوسیتوشیمی:
با استفاده از روش ایمنوسیتوشیمی می توان محل آنتی ژنهای مختلف در داخل سلولها، سطح سلولها و یا در بافت را بوسیله آنتی بادیهای نشان دار شده ( چه مستقیمأ و چه از طریق یک آنتی بادی ثانویه نشاندار شده ) و مطالعه توسط میکروسکوپ تشخیص داد. این روش خصوصأ در کنار مطالعه معمول پاتولوژیک بافت، اطلاعات ارزشمندی از نحوه پراکندگی سلولهای حامل یک آنتی ژن خاص بدست می دهد و می توان از آن در تمایز انواع مختلف سلولهای توموری، ارگانسیم های عفونی و سلولهای التهابی در یک بافت خاص کمک قابل توجهی گرفت. بطور کلی می توان گفت که در این موارد بکارگیری آنتی بادیهای منوکلونال اختصاصیت بهتری در مقایسه با آنتی بادیهای پلی کلونال دارد ولی در مواردی از جمله از دست رفتن اپی توپ مورد نظر در جریان ثابت کردن (fixation) بافت، آنتی بادیهای منوکلونال ارزش خود را از دست می دهند. بنابراین بهتر است برای شناسایی برخی از آنتی ژنها، خصوصأ در بافت ثابت شده از آنتی بادی پلی کلونال استفاده شود. برای نشاندار کردن آنتی بادی های پلی کلونال در ایمنوسیتوشیمی غالبأ از آنزیم ها و سوبستراهایی که رنگهای نامحلول ایجاد می کنند مانند DAB و آلکالین فسفاتاز و یا از مواد فلئورسانس مانند فلئورسئین یا FITC استفاده می شود.
ج) فلوسیتومتری
در این روش از یک یا چند آنتی بادی نشاندار شده با مواد مولد فلئورسانس که قادر به شناسایی سلولهای مورد نظر هستند برای تعقیب این سلولها توسط دستگاه فلوسیتومتر استفاده می شود. این دستگاه بر طبق داشتن و یا نداشتن فلئورسانس مخلوطی از سلولها را از یکدیگر جدا می کند. این روش خصوصأ در سالهای جدید استفاده های تشخیصی بسیار یافته است. با استفاده از فلوسیتومتری می توان زیر گروههای سلولی را در خون، مغز استخوان و یا مایعات دیگر بدن برحسب آنتی ژن مورد نظر شناسایی کرد و بدین ترتیب موارد افزایش و یا کاهش هر زیر گروه را به دقت ارزیابی نمود. حتی می توان نوع سایتوکاین های ترشحی یک سلول را نیز مشخص نمود. بدیهی است که در این مورد امکان استفاده از آنتی بادی پلی کلونال وجود ندارد و تنها آنتی بادیهای مورد استفاده از نوع منوکلونال هستند.
د) تشخیص in-vivo :
در حال حاضر آنتی بادیهای منوکلونال متعددی برای ردیابی موارد بیماری مانند: انواع تومورها ( سرطان ریه، پروستات، کلون، تخمدان)، بیماری قلبی، التهابات و عفونت در بدن انسان وجود دارد. در اینگونه موارد از آنتی بادی ضد آنتی ژن اختصاصی بافت بیمار که معمولأ تغییر یافته آنتی ژن طبیعی و یا نوعی از آن است که در حالت طبیعی در سطح سلول بیان نمی شود ( میوزین )، استفاده می شود بدین ترتیب که این آنتی بادی را با یک رادیوایزوتوپ نشاندار می کنند و پس از تزریق این آنتی بادی نشاندار شده محل قرارگیری آنرا در بدن ردیابی می کنند.
از این روش برای تعیین محل توده های سرطانی قبل از عمل جراحی و یا برای تعیین محل و شدت تخریب بافت میوکاردپس از انفارکتوس و یا تعیین محل و شدت آمبولی ریه و یا ترومبوزهای وریدی استفاده می شود. مشخص است که در این مورد هم به غیر از آنتی بادیهای منوکلونال انتخاب دیگری قابل استفاده نیست.
2) کاربردهای درمانی
ایده درمان اختصاصی بیماری توسط آنتی بادیها به اوائل قرن بیستم وقتی که پل ارلیخ (Paul Erlich) از آنتی سرم پلی کلونال برای القاء ایمنی غیر فعال استفاده کرد، بر می گردد. ولی به علت اینکه اکثر آنتی بادیهای تولید شده، چه پلی کلونال و چه منوکلونال، با منشاء حیوانی بوده اند و سبب برانگیختن پاسخ ایمنی در انسان می شده اند، استفاده از درمانهای مبتنی بر آنتی بادی منوکلونال، در انسان محدود بوده است؛ ولی عرضه آنتی بادیهای نوترکیب کایمریک و بتازگی، آنتی بادیهای با منشاء انسانی سبب شده است که موارد استفاده آنتی بادیهای منوکلونال در درمان بیماریها گسترش یابد.