سید لفته فردزاده
4th August 2015, 09:30 AM
تسوت، گیاه شناس روسی به عنوان کاشف پدیده کروماتوگرافی شناخته شده است. او در اواخر قرن نوزدهم برای جداسازی رنگدانه‌های برگ سبز از یک ستون پرشده با کلسیم کربنات استفاده نمود. پس از او، دانشمندان زیادی در توسعه تئوری و روش کروماتوگرافی نقش داشته‌اند. از جمله مارتین و سینج که به علت توصیف کروماتوگرافی تقسیمی موفق به اخذ جایزه نوبل در سال ۱۹۵۲ شدند. در همان سال مارتین به همراه جیمز روش کروماتوگرافی گاز- مایع را معرفی نمود. تلاش‌ها و کوشش‌های این دانشمندان باعث گردید تا امروزه این روش به عنوان یکی از مهمترین روشهای کروماتوگرافی در تمامی شاخه‌های شیمی و علوم زیستی مطرح شود.
واژه کروماتوگرافی امروزه به دسته‌ای از روشها اطلاق می‌شود که در آنها جداسازی اجزاء موجود در یک نمونه مخلوط، بر اساس تمایل نسبی هر جزء به فاز ساکن هنگام عبور فاز متحرک از روی و یا درون فاز ساکن است. گونه‌ای که تمایل بیشتری به فاز متحرک دارد با سرعت بیشتری حرکت می‌کند و بالعکس گونه‌ای که به فاز ساکن تمایل بیشتری دارد، با سرعت کمتری در طول ستون حرکت می‌کند.
به علت آن که مواد با درجات گوناگون به فازهای ساکن تمایل دارند، می‌توان از این خاصیت جهت جداسازی آنها از یکدیگر استفاده نمود. زمان مورد نیاز برای حرکت هر جزء در فاصله مشخص را می‌توان برای تجزیه‌های کیفی به کار برد. همچنین مقدار اندازه‌گیری شده برای هر جزء جدا شده نیز جهت تجزیه کمی سودمند است.
کروماتوگرافی با توجه به طبیعت فازهای ساکن و متحرک به دسته‌های مختلفی تقسیم می‌شود. برخی از روشهای متداول کروماتوگرافی در جدول زیر ذکر شده است.
جدول ۱- روشهای متداول کروماتوگرافی
نوع
فاز متحرک
فاز ساکن
گاز- مایع
گاز
مایع جذب شده روی جامد
گاز- جامد
گاز
جامد
زوج یون
مایع
مایع
تبادل یون
مایع
رزین تبادل یون
مایع- مایع
مایع
مایع جذب شده روی جامد
مایع – جامد
مایع
جامد
لایه نازک
مایع
جامد
کاغذ
مایع
مایع روی کاغذ جامد
دفع بر اساس اندازه
مایع
ژل
کروماتوگرافی فوق بحران
مایع فوق بحرانی
گونه‌های آلی متصل به سطح جامد
کروماتوگرافی مایع یکی از انواع کروماتوگرافی است که فاز متحرک در آن مایع است. کروماتوگرافی گازی نیز روش دیگری است که در آن فاز متحرک گاز است. اگر فاز متحرک گاز و فاز ساکن مایع باشد، روش را کروماتوگرافی گاز- مایع می‌نامند. روشهای کروماتوگرافی گاز- جامد، مایع- مایع و مایع- جامد نیز وجود دارند.
کروماتوگرام ، نموداری از پاسخ آشکارساز بر حسب زمان، حجم فاز متحرک یا فاصله است. اطلاعات مفیدی نظیر میزان پیچیدگی نمونه، تعداد اجزاء موجود در نمونه، مشخصات کیفی اجزای نمونه، درک کمی از درصد گونه‌ها موجود در نمونه و مشخصه‌های کارایی ستون، به سادگی از کروماتوگرام قابل حصول هستند.
در HPLC اغلب از ستونهای پر شده با ذرات ریز فاز ساکن استفاده می‌شود. به همین علت سطح بیشتری از فاز ساکن در ستون در معرض اجزاء نمونه قرار می‌گیرد و در نتیجه راندمان جداسازی در این روش بیشتر از سایر روشهای کروماتوگرافی است.
در سیستم HPLC با استفاده از یک سوزن مخصوص وارد پیش ستون مربوطه می‌شود. هم زمان از یک حلال مخصوص جهت ترکیب شدن با نمونه استفاده می‌شود. سپس نمونه با حلال مورد نظر ترکیب شده و وارد ستون مربوطه می شود و بر اساس میزان قطبیت حلال و ترکیب از یکدیگر جدا می‌شوند. همچنین نمونه بر اساس زمان بازداری از یکدیگر تفکیک می‌شوند. شکل زیر اجزای یک سیستم HPLC را نشان میدهد.
برخی کاربردها:
۱- جداسازی، خالص سازی و شناسائی پروتئین ها و ترکیبات آلی بویژه ترکیبات داروئی. همچنین در برخی از آزمایش های مربوط به تعیین غلظت داروها مورد استفاده قرار می گیرد .
۲- در تحقیقات پروتومیک (تحقیقاتی که برروی پروتئین ها انجام می شود)، آنالیز و هضم پروتئین
۳- تعیین ساختار پلیمرها
۴- مقایسه ساختارهای پروتئین های مختلف
پیش از دهه ۱۹۷۰ روشهای بسیار کم و غیر قابل اعتمادی جهت کروماتوگرافی در آزمایشگاههای دانشمندان وجود داشت.
در طول دهه ۱۹۷۰ بیشتر جداسازی مواد شیمیایی توسط روشهای متعددی انجام می شده که شامل کروماتوگرافی ستونی ، کروماتوگرافی کاغذی و کروماتوگرافی لایه نازک بوده است. بهر حال این تکنیکهای کروماتوگرافی جهت شناسایی و تعین غلظت بین مواد مشابه و یکسان کافی نبود.
توسعه کروماتوگرافی مایع با فشار بالا در اواسط دهه ۱۹۷۰ انجام شد و پیشرفت و تکامل آن مقارن شد با تکامل مواد پک شده درون ستون کروماتوگرافی و همچنین ردیابهای اتوماتیکی که می توانستند بصورت آنلاین مقدار عبور مایع را محاسبه نمایند.
در اواخر دهه ۱۹۷۰ ، روشهای جدیدی شامل کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس این امکان را فراهم کرد تا جداسازی ترکیبات بسیار مشابه ، عملی گردد. در دهه ۱۹۸۰ ، بطور رایجتری از HPLC برای جداسازی ترکیبات شیمیایی استفاده می شده است.
تکنیکهای جدید روشهای جداسازی ، شناسایی ، خالص سازی و محاسبه مقدار را متفاوت از گذشته توسعه داد. همچنین برای تسهیل در کار HPLC ، کامپیوتر و اتوماسیون به سایر روشها اضافه گردید.
به مرور تکامل انواع ستونها ، تولید ستونهای بسیار باریک ، ستونهای پیوسته باعث سرعت در کار HPLC گردید. در دهه گذشته شاهد ظهور میکرو ستونها و ستونهای تخصصی شده برای HPLC بوده ایم. قطر معمول میکروستونها یا ستونهای مویی شکل ، حدود µm ۳ تا µm ۲۰۰ دارد.
طول ستونهای HPLC سریع ، کمتر از ستونهای HPLC معمولی و برابر mm ۳ است و در بخشهای بسیار کوچک در دستگاه HPLC جاسازی می گردند.
هر چند که امروزه HPLC مورد توجه تحقیقات بیوتکنولوژیکی ، شیمیایی و بیوشیمیایی و همچنین صنایع داروسازی است اما این موارد فقط ۵۰ درصد استفاده کنندگان HPLC را نشان میدهد.
در حال حاضر از HPLC در صنایع آرایشی ، غذایی ، تولید انرژی و صنایع زیست محیطی استفاده می شود.
کروماتوگرافی مایع با کارائی بالا (HPLC)
کروماتوگرافی مایع با کارائی بالا (HPLC)
اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه HPLC
1- مخازن محلول :
که در آنها فاز متحرک و یا محلول های شستشو دهنده ستون ریخته شده است.
۲- موتور یا پمپ:
چون ستونها نسبتا طویل و اندازه ذرات کم است. به این جهت قابلیت نفوذ کم می شود و برای این که محلول جریان داشته باشد باید فشار وجود داشته باشد. برای ایجاد فشار از پمپ ها استفاده می کنیم. پمپ فشاری حدود psi 4500 می تواند ایجاد کند و باید فشار آن ثابت باشد.
محلول توسط پمپ با جریان ثابتی بر روی فاز ثابت حرکت داده می شود. حداکثر جریانی که فاز متحرک می تواند داشته باشد ۲،۵ملی لیتر در یک دقیقه است. و نظر به نوع کاری که می خواهیم انجام دهیم فلو یا جریان فرق می کند. هر چه جریان کمتر باشد، فاصله پیک ها بیشتر است.
میزان فشار بستگی به جریان دارد وقتی جریان ml/min 0.8 است میزان فشار حدود psi 1500 می شود. میزان فشار بستگی به نوع ستون دارد حداکثر فشار مجاز Psi 3500 است. حداکثر تغییرات فشار Psi 100 است. حداکثر فلوریت Flow rate ، ml/min 2.5 است. پس پمپ، محلول را از مخزن می گیرد و با سرعت معین آن را بداخل دستگاه وارد می کند.
به دو روش می توانیم کار کنیم:
الف: روش ایزوکراتیک isocratic
اگر نسبت های مختلفی از فاز متحرک را در یک مخزن بریزیم و از همان مخزن فاز متحرک را برداشت کنیم از روش ایزوکراتیک استفاده کرده ایم.
ب: روش گرادیانت gradient :
اجزاء فاز متحرک در مخازن مختلف قرار دارند. دستگاه قابلیت این را دارد که خودش نسبت های مختلف را از مخازن برداشت کند، مثلا می خواهیم ازمخزن اول ۸۰ فیصد از مخزن دوم ۸ فیصد و از مخزن سوم ۱۲ فیصدبکشد و بعد نسبت ها را مخلوط می کند. از این روش وقتی استفاده می کنیم که نسبت های موردنظر را نمی دانیم و بخواهیم روش کارپیدا کنیم. ولی وقتی درصد فاز متحرک برای ما روشن شد می توانیم از روش ایزوکراتیک استفاده کنیم. فاز متحرک با جریان ثابتی بر روی ستون حرکت داده می شود.
حداکثر فلو یا جریان در این تجربه ml/min0.8 یا ۱ است. بعد از فعال کردن هر پمپ flow rate را از کم به زیاد کم کم بالا می بریم تا حدود ml/min ۰٫۸ یا ۱ و می گذاریم حدود پانزده دقیقه یا نیم ساعت با فلوریت بالا کار کند و بعد فلوریت را به تدریج پایین می آوریم تا صفر و بعد پمپ را عوض می کنیم. یا دستگاه را خاموش می کنیم، فلوریت که بالا برود فشار هم بالا می رود. بعد از اتمام کار ستون را با محلول های شستشو دهنده می شوئیم. محلول های شستشو را در مخازن ریخته و پمپ ها را به ترتیب فعال می کنیم اول دستگاه را با آب و متیانول شسته و سپس با متیانول خالص می شوئیم. هر پمپ را که فعال کردیم باید ابتدا هوا گیری کنیم.
۳- انجکتر injector:
از سوزن های مختلف با ظرفیت های مختلف استفاده می کنیم. حجم تزریق ۳- میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد قسمتی بنام گارد کالوم یا پری کالوم می شود که محافظ ستون است، طول کاردکالوم حدو یک سانتی متر است. و جنس آن از فولاد ضد زنگ است، و ماده پرکننده آن از جنس ماده پرکننده ستون است. اگر ماده مورد تشخیص ناخالصی داشته باشد یا با ماده داخل ستون عملیه کیمیاوی ایجاد کند درگاردکالوم انجام می شود و به ستون آسیبی نمی رسد.
۴- ستون:
طول ستونهای دستگاه حدود ۳۰-۱۰ سانتی متر است. و جنس آن از فولاد ضدزنگ است. پرمصرف ترین ستون C18 ، ODS آکتا دسیل سیلان است، ستونها را پس از اتمام کار باید با محلولهای شستشو دهنده شست. اگر از بافرفسفات استفاده کردیم ستون را با آب و متیانول و بعد با متیانول خالص شستشو می دهیم.
فاز ثابت بصورت ذرات ریزی در داخل ستون قرار گرفته است که بر اثر چسبیدن و پخش شدن اجزاء نمونه و عبور فاز متحرک جداسازی انجام می شود. نمونه ابتدا وارد گاردکالوم و بعد وارد ستون می شود. ODS اکتا دسیل سیلان گروههای الکیل غیرقطبی زیادی دارد، فاز متحرکی که استفاده می کنیم اکثرا قطبی است. فاز متحرک و ماده پرکننده ستون از نظر قطبیت باید عکس هم باشند.
در HPLC امکان استفاده از فاز نرمال و معکوس هست. اگر فاز ثابت قطبی و فاز متحرک غیرقطبی باشد سیستم را فاز نرمال و در صورتی که ستون غیرقطبی و محلول قطبی باشد درین صورت سیستم را فاز معکوس می گویند. مشتقات آلکیل سیلان و فنیل سیلان ایجاد ستونهای غیر قطبی می کنند و معمولا ستون غیر قطبی و فاز متحرک قطبی است بنابراین از فاز معکوس استفاده می شود. جنس ستونها از Moneygram money transfer فولاد ضدزنگ یا Stainless steel است.
۵- دتکتور ها:
دتکتور ها باید حساس باشند و اثر مخرب بر روی اجسام نداشته باشند. پاسخ آنها تا حدود وسیعی برای غلظت باید خطی باشد.
انواع دتکتور ها:
(a)- مهمترین آنها دتکتور ماورا بنفش است که برای اجسامی که در ناحیه UV-VIS جذب داشته باشند مورد استفاده قرار می گیرد. در این دتکتور جذب انجام می شود و باعث کاسته شدن انرژی می شود که این کاسته شدن قابل اندازه گیری است. میزان کاسته شدن انرژی متناسب است با غلظت، باید طول موج را مشخص کنیم که در اینجاnm λ=۲۲۵ است. محلول نباید در طول موج انتخابی جذب داشته باشد..
(b)- دتکتور ضریب شکست، این دتکتور خیلی حساس به حرارت است. از تغییرات یا تفاوتی که بین ضریب شکست سیستم محلول به تنهایی و سیستم محلول همراه نمونه ایجاد می شود استفاده می کنیم.
(c)- دتکتور فلورسانس حساس تر از UV است ولی کم استفاده می باشد چون موادی که خاصیت فلورسانس داشته باشند کم هستند.
(d)- دتکتور الکتروشیمیایی که عملکرد آن بر مبنای عملیه های اکسید و احیا می باشد.
۶- ثبت کننده (ریکاردر):
در اثر حرکات قلم پیک هائی رسم می شود که به مجموعه آنها کروماتوگرام می گویند. به طریق کیفی پیک ها را براساس زمان اقامت یا نگهداری یا Retention time می شناسند. زمان اقامتت فاصله زمانی از لحظه تزریق تا رسیدن به نقطه اوج یک پیک است. برای محاسبه کمی سطح هر نوار جذبی را حساب می کنیم، سطح هر نوار جذبی متناسب با مقدار جسم است که بوسیله انتگراتور یا سطح سنج با دستگاه ثبات بدست می آید سطح هر نوار جذبی یعنی حاصلضرب قاعده و نصف ارتفاع است. روش بریدن نوار و وزن کردن آنها روش قدیمی است ولی امروزه توسط سطح سنج یا انتگراتور بدست می آید خود دستگاه AUC را مشخص می کند. می توان از ارتفاع هم استفاده کرد و نسبت ارتفاع ها را مشخص کنیم AUC و ارتفاع با یک دستور ساده قابل تبدیل بهم هستند.
طریقه عمل ستون HPLC
کار این ستون نیز به اندازه ذرات داخل ستون بستگی دارد. هرچه اندازه ذرات کوچک‌تر باشد، کیفیت HPLC پیشتر می‌شود.
فاز ساکن و فاز متحرک
در مورد فازهای ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد و آن ، این است که باید خاصیت قطبی بودن حل‌شونده و فاز متحرک ، نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد. ترتیب قطبیت گروههای عاملی در ترکیبات به صورت زیر است:
هایدروکاربن< ایترها < استرها < کیتن‌ها < الدهایدها < آمیدها < آمین‌ها < الکول‌ها
به عنوان مثال ، فاز ساکن با قطبیت بالا مثل سیلیکات یا آلومین یا مایعات قطبی مثل تری‌اتیلن گلیگول که روی ذرات سیلیکات قرار گرفته‌اند و فاز متحرک ، محلول نسبتا غیر قطبی مثل هگزان یا ایزو پروپیل اتر را می‌توان نام برد.
خصوصیات فاز متحرک ( HPLC )
خالص بودن
نقطه جوش حدود ۲۰ تا ۵۰ بالاتر از درجه حرارت ستون
چسپناکی کم
تعامل پذیری کم
قابلیت تطابق با آشکارساز
سمیت و اشتعال پذیری کم
مزایای HPLC
کاربرد HPLC برای مواد غیر فرار به قرار زیر میباشد:
از ستونهای طولانی که سرعت محلول در تمام طول آنها نزدیک به مطلوب‌ترین سرعت باشد، می‌توان استفاده کرد و امکان تغییر دادن ماهیت فاز متحرک برای انجام شستشوی تدریجی و شستشوی مرحله‌ای یا هر دو وجود دارد.
آشکارساز
آشکارسازهای مورد استفاده در کروماتوگرافی مایع – مایع تمام خصوصیات آشکارسازهای کروماتوگرافی گازی را دارند، بجز اینکه در آشکارساز کروماتوگرافی مایع نیازی به محدوده حرارت بالا نیست. این شناساگرها کلا دو دسته‌اند:
یک نوع کلی که به فاز متحرک عکس‌العمل نشان می‌دهند.
نوع خاصی که به حل شونده حساس هستند.
واژه کروماتوگرافی امروزه به دسته‌ای از روشها اطلاق می‌شود که در آنها جداسازی اجزاء موجود در یک نمونه مخلوط، بر اساس تمایل نسبی هر جزء به فاز ساکن هنگام عبور فاز متحرک از روی و یا درون فاز ساکن است. گونه‌ای که تمایل بیشتری به فاز متحرک دارد با سرعت بیشتری حرکت می‌کند و بالعکس گونه‌ای که به فاز ساکن تمایل بیشتری دارد، با سرعت کمتری در طول ستون حرکت می‌کند.
به علت آن که مواد با درجات گوناگون به فازهای ساکن تمایل دارند، می‌توان از این خاصیت جهت جداسازی آنها از یکدیگر استفاده نمود. زمان مورد نیاز برای حرکت هر جزء در فاصله مشخص را می‌توان برای تجزیه‌های کیفی به کار برد. همچنین مقدار اندازه‌گیری شده برای هر جزء جدا شده نیز جهت تجزیه کمی سودمند است.
کروماتوگرافی با توجه به طبیعت فازهای ساکن و متحرک به دسته‌های مختلفی تقسیم می‌شود. برخی از روشهای متداول کروماتوگرافی در جدول زیر ذکر شده است.
جدول ۱- روشهای متداول کروماتوگرافی
نوع
فاز متحرک
فاز ساکن
گاز- مایع
گاز
مایع جذب شده روی جامد
گاز- جامد
گاز
جامد
زوج یون
مایع
مایع
تبادل یون
مایع
رزین تبادل یون
مایع- مایع
مایع
مایع جذب شده روی جامد
مایع – جامد
مایع
جامد
لایه نازک
مایع
جامد
کاغذ
مایع
مایع روی کاغذ جامد
دفع بر اساس اندازه
مایع
ژل
کروماتوگرافی فوق بحران
مایع فوق بحرانی
گونه‌های آلی متصل به سطح جامد
کروماتوگرافی مایع یکی از انواع کروماتوگرافی است که فاز متحرک در آن مایع است. کروماتوگرافی گازی نیز روش دیگری است که در آن فاز متحرک گاز است. اگر فاز متحرک گاز و فاز ساکن مایع باشد، روش را کروماتوگرافی گاز- مایع می‌نامند. روشهای کروماتوگرافی گاز- جامد، مایع- مایع و مایع- جامد نیز وجود دارند.
کروماتوگرام ، نموداری از پاسخ آشکارساز بر حسب زمان، حجم فاز متحرک یا فاصله است. اطلاعات مفیدی نظیر میزان پیچیدگی نمونه، تعداد اجزاء موجود در نمونه، مشخصات کیفی اجزای نمونه، درک کمی از درصد گونه‌ها موجود در نمونه و مشخصه‌های کارایی ستون، به سادگی از کروماتوگرام قابل حصول هستند.
در HPLC اغلب از ستونهای پر شده با ذرات ریز فاز ساکن استفاده می‌شود. به همین علت سطح بیشتری از فاز ساکن در ستون در معرض اجزاء نمونه قرار می‌گیرد و در نتیجه راندمان جداسازی در این روش بیشتر از سایر روشهای کروماتوگرافی است.
در سیستم HPLC با استفاده از یک سوزن مخصوص وارد پیش ستون مربوطه می‌شود. هم زمان از یک حلال مخصوص جهت ترکیب شدن با نمونه استفاده می‌شود. سپس نمونه با حلال مورد نظر ترکیب شده و وارد ستون مربوطه می شود و بر اساس میزان قطبیت حلال و ترکیب از یکدیگر جدا می‌شوند. همچنین نمونه بر اساس زمان بازداری از یکدیگر تفکیک می‌شوند. شکل زیر اجزای یک سیستم HPLC را نشان میدهد.
برخی کاربردها:
۱- جداسازی، خالص سازی و شناسائی پروتئین ها و ترکیبات آلی بویژه ترکیبات داروئی. همچنین در برخی از آزمایش های مربوط به تعیین غلظت داروها مورد استفاده قرار می گیرد .
۲- در تحقیقات پروتومیک (تحقیقاتی که برروی پروتئین ها انجام می شود)، آنالیز و هضم پروتئین
۳- تعیین ساختار پلیمرها
۴- مقایسه ساختارهای پروتئین های مختلف
پیش از دهه ۱۹۷۰ روشهای بسیار کم و غیر قابل اعتمادی جهت کروماتوگرافی در آزمایشگاههای دانشمندان وجود داشت.
در طول دهه ۱۹۷۰ بیشتر جداسازی مواد شیمیایی توسط روشهای متعددی انجام می شده که شامل کروماتوگرافی ستونی ، کروماتوگرافی کاغذی و کروماتوگرافی لایه نازک بوده است. بهر حال این تکنیکهای کروماتوگرافی جهت شناسایی و تعین غلظت بین مواد مشابه و یکسان کافی نبود.
توسعه کروماتوگرافی مایع با فشار بالا در اواسط دهه ۱۹۷۰ انجام شد و پیشرفت و تکامل آن مقارن شد با تکامل مواد پک شده درون ستون کروماتوگرافی و همچنین ردیابهای اتوماتیکی که می توانستند بصورت آنلاین مقدار عبور مایع را محاسبه نمایند.
در اواخر دهه ۱۹۷۰ ، روشهای جدیدی شامل کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس این امکان را فراهم کرد تا جداسازی ترکیبات بسیار مشابه ، عملی گردد. در دهه ۱۹۸۰ ، بطور رایجتری از HPLC برای جداسازی ترکیبات شیمیایی استفاده می شده است.
تکنیکهای جدید روشهای جداسازی ، شناسایی ، خالص سازی و محاسبه مقدار را متفاوت از گذشته توسعه داد. همچنین برای تسهیل در کار HPLC ، کامپیوتر و اتوماسیون به سایر روشها اضافه گردید.
به مرور تکامل انواع ستونها ، تولید ستونهای بسیار باریک ، ستونهای پیوسته باعث سرعت در کار HPLC گردید. در دهه گذشته شاهد ظهور میکرو ستونها و ستونهای تخصصی شده برای HPLC بوده ایم. قطر معمول میکروستونها یا ستونهای مویی شکل ، حدود µm ۳ تا µm ۲۰۰ دارد.
طول ستونهای HPLC سریع ، کمتر از ستونهای HPLC معمولی و برابر mm ۳ است و در بخشهای بسیار کوچک در دستگاه HPLC جاسازی می گردند.
هر چند که امروزه HPLC مورد توجه تحقیقات بیوتکنولوژیکی ، شیمیایی و بیوشیمیایی و همچنین صنایع داروسازی است اما این موارد فقط ۵۰ درصد استفاده کنندگان HPLC را نشان میدهد.
در حال حاضر از HPLC در صنایع آرایشی ، غذایی ، تولید انرژی و صنایع زیست محیطی استفاده می شود.
کروماتوگرافی مایع با کارائی بالا (HPLC)
کروماتوگرافی مایع با کارائی بالا (HPLC)
اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه HPLC
1- مخازن محلول :
که در آنها فاز متحرک و یا محلول های شستشو دهنده ستون ریخته شده است.
۲- موتور یا پمپ:
چون ستونها نسبتا طویل و اندازه ذرات کم است. به این جهت قابلیت نفوذ کم می شود و برای این که محلول جریان داشته باشد باید فشار وجود داشته باشد. برای ایجاد فشار از پمپ ها استفاده می کنیم. پمپ فشاری حدود psi 4500 می تواند ایجاد کند و باید فشار آن ثابت باشد.
محلول توسط پمپ با جریان ثابتی بر روی فاز ثابت حرکت داده می شود. حداکثر جریانی که فاز متحرک می تواند داشته باشد ۲،۵ملی لیتر در یک دقیقه است. و نظر به نوع کاری که می خواهیم انجام دهیم فلو یا جریان فرق می کند. هر چه جریان کمتر باشد، فاصله پیک ها بیشتر است.
میزان فشار بستگی به جریان دارد وقتی جریان ml/min 0.8 است میزان فشار حدود psi 1500 می شود. میزان فشار بستگی به نوع ستون دارد حداکثر فشار مجاز Psi 3500 است. حداکثر تغییرات فشار Psi 100 است. حداکثر فلوریت Flow rate ، ml/min 2.5 است. پس پمپ، محلول را از مخزن می گیرد و با سرعت معین آن را بداخل دستگاه وارد می کند.
به دو روش می توانیم کار کنیم:
الف: روش ایزوکراتیک isocratic
اگر نسبت های مختلفی از فاز متحرک را در یک مخزن بریزیم و از همان مخزن فاز متحرک را برداشت کنیم از روش ایزوکراتیک استفاده کرده ایم.
ب: روش گرادیانت gradient :
اجزاء فاز متحرک در مخازن مختلف قرار دارند. دستگاه قابلیت این را دارد که خودش نسبت های مختلف را از مخازن برداشت کند، مثلا می خواهیم ازمخزن اول ۸۰ فیصد از مخزن دوم ۸ فیصد و از مخزن سوم ۱۲ فیصدبکشد و بعد نسبت ها را مخلوط می کند. از این روش وقتی استفاده می کنیم که نسبت های موردنظر را نمی دانیم و بخواهیم روش کارپیدا کنیم. ولی وقتی درصد فاز متحرک برای ما روشن شد می توانیم از روش ایزوکراتیک استفاده کنیم. فاز متحرک با جریان ثابتی بر روی ستون حرکت داده می شود.
حداکثر فلو یا جریان در این تجربه ml/min0.8 یا ۱ است. بعد از فعال کردن هر پمپ flow rate را از کم به زیاد کم کم بالا می بریم تا حدود ml/min ۰٫۸ یا ۱ و می گذاریم حدود پانزده دقیقه یا نیم ساعت با فلوریت بالا کار کند و بعد فلوریت را به تدریج پایین می آوریم تا صفر و بعد پمپ را عوض می کنیم. یا دستگاه را خاموش می کنیم، فلوریت که بالا برود فشار هم بالا می رود. بعد از اتمام کار ستون را با محلول های شستشو دهنده می شوئیم. محلول های شستشو را در مخازن ریخته و پمپ ها را به ترتیب فعال می کنیم اول دستگاه را با آب و متیانول شسته و سپس با متیانول خالص می شوئیم. هر پمپ را که فعال کردیم باید ابتدا هوا گیری کنیم.
۳- انجکتر injector:
از سوزن های مختلف با ظرفیت های مختلف استفاده می کنیم. حجم تزریق ۳- میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد قسمتی بنام گارد کالوم یا پری کالوم می شود که محافظ ستون است، طول کاردکالوم حدو یک سانتی متر است. و جنس آن از فولاد ضد زنگ است، و ماده پرکننده آن از جنس ماده پرکننده ستون است. اگر ماده مورد تشخیص ناخالصی داشته باشد یا با ماده داخل ستون عملیه کیمیاوی ایجاد کند درگاردکالوم انجام می شود و به ستون آسیبی نمی رسد.
۴- ستون:
طول ستونهای دستگاه حدود ۳۰-۱۰ سانتی متر است. و جنس آن از فولاد ضدزنگ است. پرمصرف ترین ستون C18 ، ODS آکتا دسیل سیلان است، ستونها را پس از اتمام کار باید با محلولهای شستشو دهنده شست. اگر از بافرفسفات استفاده کردیم ستون را با آب و متیانول و بعد با متیانول خالص شستشو می دهیم.
فاز ثابت بصورت ذرات ریزی در داخل ستون قرار گرفته است که بر اثر چسبیدن و پخش شدن اجزاء نمونه و عبور فاز متحرک جداسازی انجام می شود. نمونه ابتدا وارد گاردکالوم و بعد وارد ستون می شود. ODS اکتا دسیل سیلان گروههای الکیل غیرقطبی زیادی دارد، فاز متحرکی که استفاده می کنیم اکثرا قطبی است. فاز متحرک و ماده پرکننده ستون از نظر قطبیت باید عکس هم باشند.
در HPLC امکان استفاده از فاز نرمال و معکوس هست. اگر فاز ثابت قطبی و فاز متحرک غیرقطبی باشد سیستم را فاز نرمال و در صورتی که ستون غیرقطبی و محلول قطبی باشد درین صورت سیستم را فاز معکوس می گویند. مشتقات آلکیل سیلان و فنیل سیلان ایجاد ستونهای غیر قطبی می کنند و معمولا ستون غیر قطبی و فاز متحرک قطبی است بنابراین از فاز معکوس استفاده می شود. جنس ستونها از Moneygram money transfer فولاد ضدزنگ یا Stainless steel است.
۵- دتکتور ها:
دتکتور ها باید حساس باشند و اثر مخرب بر روی اجسام نداشته باشند. پاسخ آنها تا حدود وسیعی برای غلظت باید خطی باشد.
انواع دتکتور ها:
(a)- مهمترین آنها دتکتور ماورا بنفش است که برای اجسامی که در ناحیه UV-VIS جذب داشته باشند مورد استفاده قرار می گیرد. در این دتکتور جذب انجام می شود و باعث کاسته شدن انرژی می شود که این کاسته شدن قابل اندازه گیری است. میزان کاسته شدن انرژی متناسب است با غلظت، باید طول موج را مشخص کنیم که در اینجاnm λ=۲۲۵ است. محلول نباید در طول موج انتخابی جذب داشته باشد..
(b)- دتکتور ضریب شکست، این دتکتور خیلی حساس به حرارت است. از تغییرات یا تفاوتی که بین ضریب شکست سیستم محلول به تنهایی و سیستم محلول همراه نمونه ایجاد می شود استفاده می کنیم.
(c)- دتکتور فلورسانس حساس تر از UV است ولی کم استفاده می باشد چون موادی که خاصیت فلورسانس داشته باشند کم هستند.
(d)- دتکتور الکتروشیمیایی که عملکرد آن بر مبنای عملیه های اکسید و احیا می باشد.
۶- ثبت کننده (ریکاردر):
در اثر حرکات قلم پیک هائی رسم می شود که به مجموعه آنها کروماتوگرام می گویند. به طریق کیفی پیک ها را براساس زمان اقامت یا نگهداری یا Retention time می شناسند. زمان اقامتت فاصله زمانی از لحظه تزریق تا رسیدن به نقطه اوج یک پیک است. برای محاسبه کمی سطح هر نوار جذبی را حساب می کنیم، سطح هر نوار جذبی متناسب با مقدار جسم است که بوسیله انتگراتور یا سطح سنج با دستگاه ثبات بدست می آید سطح هر نوار جذبی یعنی حاصلضرب قاعده و نصف ارتفاع است. روش بریدن نوار و وزن کردن آنها روش قدیمی است ولی امروزه توسط سطح سنج یا انتگراتور بدست می آید خود دستگاه AUC را مشخص می کند. می توان از ارتفاع هم استفاده کرد و نسبت ارتفاع ها را مشخص کنیم AUC و ارتفاع با یک دستور ساده قابل تبدیل بهم هستند.
طریقه عمل ستون HPLC
کار این ستون نیز به اندازه ذرات داخل ستون بستگی دارد. هرچه اندازه ذرات کوچک‌تر باشد، کیفیت HPLC پیشتر می‌شود.
فاز ساکن و فاز متحرک
در مورد فازهای ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد و آن ، این است که باید خاصیت قطبی بودن حل‌شونده و فاز متحرک ، نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد. ترتیب قطبیت گروههای عاملی در ترکیبات به صورت زیر است:
هایدروکاربن< ایترها < استرها < کیتن‌ها < الدهایدها < آمیدها < آمین‌ها < الکول‌ها
به عنوان مثال ، فاز ساکن با قطبیت بالا مثل سیلیکات یا آلومین یا مایعات قطبی مثل تری‌اتیلن گلیگول که روی ذرات سیلیکات قرار گرفته‌اند و فاز متحرک ، محلول نسبتا غیر قطبی مثل هگزان یا ایزو پروپیل اتر را می‌توان نام برد.
خصوصیات فاز متحرک ( HPLC )
خالص بودن
نقطه جوش حدود ۲۰ تا ۵۰ بالاتر از درجه حرارت ستون
چسپناکی کم
تعامل پذیری کم
قابلیت تطابق با آشکارساز
سمیت و اشتعال پذیری کم
مزایای HPLC
کاربرد HPLC برای مواد غیر فرار به قرار زیر میباشد:
از ستونهای طولانی که سرعت محلول در تمام طول آنها نزدیک به مطلوب‌ترین سرعت باشد، می‌توان استفاده کرد و امکان تغییر دادن ماهیت فاز متحرک برای انجام شستشوی تدریجی و شستشوی مرحله‌ای یا هر دو وجود دارد.
آشکارساز
آشکارسازهای مورد استفاده در کروماتوگرافی مایع – مایع تمام خصوصیات آشکارسازهای کروماتوگرافی گازی را دارند، بجز اینکه در آشکارساز کروماتوگرافی مایع نیازی به محدوده حرارت بالا نیست. این شناساگرها کلا دو دسته‌اند:
یک نوع کلی که به فاز متحرک عکس‌العمل نشان می‌دهند.
نوع خاصی که به حل شونده حساس هستند.