سید لفته فردزاده
4th August 2015, 08:16 AM
تکنولوژی انتقال پروتئین یکی از یافته های نوین در علوم زیست شناسی به شمار می آید که در دهه اخیر توجه زیادی را متوجه خویش ساخته است. در این سیستم انتقال مواد به داخل سلول به واسطه توالی های خاص پروتئینی انجام می شود. این انتقال بر خلاف روش های قدیمی که روش های با بازده پایینی بوده اند، توانسته با بازده در حدود 100 درصد عمل انتقال مواد با اندازه های بالا را انجام دهد. در این روش می توان پروتئین ها، ترکیبات شیمیایی، نانو ذرات، لیپوزوم ها و غیره را به واسطه اتصال به این دامین های منتقل شونده به سلول منتقل نمود. از کاربرهای این تکنولوژی می توان انتقال دارو به سلول و یا انتقال اولیگونوکلئوتید ها در ژن درمانی را نام برد.
مقدمه:
غشای سلولی در حالت کلی به بسیاری از مواد و ساختارهای خارجی نفوذ ناپذیر است و نتها تعداد محدودی از ساختار های کوچک می توانند به درون سلول نفوذ یابند. از این رو در علم دارو رسانی، یافتن راهی برای وارد ساختن دارو به سلول و یا اندامک های سلولی یکی از موانع راه توسعه داروها به شمار می رود. از سوی دیگر ساخت پروتئین درمانی در درون سلول نیاز به سیستم های پیچیده مهندسی ژنتیک و ژن درمانی داشته درنتیجه بهترین روش برای درمان، سنتز پروتئین در خارج سلول و وارد سازی آن به سلول بیمار است.
در راستای دست یابی به اهداف درون سلولی، روش هایی نیز ابداع گردیده که به علت برخی از نارسایی ها، یافتن راه جدیدی در ورود به سلول می تواند نقطه عطفی در علوم درمانی و دارویی باشد. هدف اصلی در این سیستم ها، رساندن ترکیباتی است که به سادگی نمی توانند به سلول وارد شوند (مانند DNA) و استفاده درمانی از این ترکیبات است. به همین منظور روشهایی چون تحریک آندوسیتوز، الکتروپوریشن، میکرواینجکشن، لیپوزوم ها و بسیاری از روش های دیگر به کار گرفته می شوند. اما این روش ها دارای محدودیت های بسیار زیادی هستند. در استفاده از تحریک اندوسیتوز، پس از ورود ترکیب مورد نظر به درون لیزوزوم، این ترکیب در معرض آنزیم ها قرار می گیرد، که در صورت حساسیت، داروی مورد نظر ما کارایی خود را از دست خواهد داد. از سوی دیگر روش هایی چون الکتروپوریشن و میکرواینجکشن علاوه بر محدودیت کاربرد، به ساختار سلول نیز آسیب وارد می کنند و ممکن است موجب تخریب سلول شوند. روش استفاده از لیپوروم ها نیز به علت حساسیت و تخریب پذیری از بازده کاری مناسبی برخوردار نیست.
با کشف پپتید های نفوذ کننده به درون سلول، راه تازه ای در رساندن دارو به درون سلول به وجود آمده و این سیستم توانسته با بازده بالا، سمیت کم و انعطاف پذیری بالا، مواد مورد نظر را به درون سلول وارد نماید. پپتید های نفوذ کننده به درون سلول (CPPs)، دامین های ترانداکشن پروتئینی (PTD)، پپتید های تروجان و پپتید های گذرنده از غشا، نام هایی است که بر این دسته از دسته از پروتئین ها می گذارند.
مقالات اخیر نشان داده است که PTD ها می توانند دامنه وسیعی از ملکول های فعال بیولوژیک مانند پروتئین ها، اولیگونوکلئوتید ها و نانو پارتیکل ها را به دامنه وسیعی از سلول ها در موجود زنده و یا در شرایط آزمایشگاهی منتقل نمایند.
PTD ها شامل دسته وسیعی از توالی های پروتئینی هستند که از نظر ساختاری، بار الکتریکی و ترکیب آمینو اسید ها بسیار متنوع هستند. تنها تشابه این گروه توانایی وارد شدن به سیتوپلاسم و هسته سلول ها است. در سال 1998، Green و همکارانش برای اولین بار نشان دادند که پروتئین TAT از ویروس HIV می تواند از غشای سلول عبور کرده و به درون سیتوپلاسم برود. در سال 1994 گروه دیگری از دانشمندان نشان دادند که توالی 16 آمینو اسیدیدر یکی از عوامل رونویسی در مگس سرکه به نام Antennapedia (Antp) و پروتئین VP22 در هرپس ویروس نیز خاصیت عبور از غشا را دارا هستند. در جدول زیر توالی و منشا تعدادی از این پپتید ها به طور خلاصه آورده شده است.
پپتید های نفوذ کننده به سلول CPPs:
نام اختصاری CPPs بهترین نامی است که می توان به پپتید هایی که توانایی وارد شدن به سلول را دارا هستند، اختصاص داد. به طور کلی این پروتئین ها را به 2 دسته تقسیم می کنند:
1- پپتید های حلقوی دو گانه دوست
2- پپتید های غنی از آرژنین
تا به حال CCPs های گوناگونی شناخته شده است که معروف ترین و شناخته شده ترین آنها عبارت اند از TAT، Antp، VP22، Transportan، MAP که در ادامه به بررسی جداگانه هر یک از این توالی ها پرداخته خواهد شد.
پروتئین TAT در ویروس ایدز:
TAT یک فعال کننده رونویسی در ویروس HIV است که دارای 86 آمینو اسید بوده و دارای بخش غنی از آمینو اسید سیستئین و یک بخش بسیار بازی 9 آمینو اسیدی که از 2 لیزین و 6 آرژنین یک آمینواسیدی دیگر تشکیل شده است و علاوه بر این دارای یک بخش متصل شونده به RNA می باشد.
این پروتئین توسط دو اگزون کد می شود که اگزون ابتدایی بخش 72 اسید آمینه ای انتهای آمینوپروتئین را کد می کند و برای فعالیت ، فعال کنندگی رونویسی در این پروتئین کافی است. مشاهده شده که در صورتی که این پروتئین را در محیط کشت سلولی قرار دهند، پروتئین می تواند وارد سلول شده و مستقیما به داخل هسته سلول برود.
مطالعات مختلف رسپتور های متفاوتی را برای TAT در سطح سلول بیان نموده اند مانند اینتگرین 90 کیلو دالتونی در سطح سلول و یا نوع دیگری از اینتگرین ها به نام avh5.
توالی مربوط به ورود به سلول که به ترانس داکشن دامین معروف است توالی آمینو اسیدی با توالی Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg است که پپتید را در ورود به سلول یاری می کند. همراه با این توالی یک توالی NLS (توالی هدایت کننده به هسته) نیز مسئول ورود پپتید به درون هسته می باشد.
بخش homeodomain از پروتئین Antennapedia
هموپروتئین ها دسته ای از فاکتور های رونویسی هستند که می توانند از طریق توالی خاص 60 آمینواسیدی به نام همودامین به DNA متصل شوند. همودامین از 3 هلیکس تشکیل شده است که هلیکس شماره 3 به هلیکس شناسایی معروف است. این هلیکس مسئول اتصال به محل اختصاصی بر روی DNA است. در مطالعه ای در زمینه شناخت اثر این پروتئین ها بر روی نمو سلولهای عصبی، مشخص شد که همو دامین از Antennapedia از مگس سرکه می تواند وارد سلولهای انسانی شده، مستقیما به طرف هسته رفته و تغییراتی در این سلولها ایجاد نماید.
مطالعات بیشتر مشخص نمود که هلیکس شماره 3 مسئول این انتقال بوده و دامین اختصاصی انتقال که penetratin نامیده شد، توالی 16 آمینو اسیدی با توالی Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys است.
پروتئین VP22 در ویروس هرپس تیپ 1
VP22 یکی از مهمترین بخش های HSV-1 است که توانایی ویژه ای در ورود به سلول را دارد. این پروتئین در سلولی که در آن تولید شده در سیتوپلاسم و در مجاورت میکروتوبولها قرار می گیرد، اما در صورتی که وارد سلولهای دیگر شود به درون هسته رفته و در مجاورت کروماتین ها قرار می گبرد.
ترانسپورتین
یک پروتئین ترکیبی است به طول 27 آمبنواسید که از اتصال نروپپتید Galanin به پروتئین واکنش دهنده با غشا به نام Mastoparan تشکیل شده است که می تواند ملکول مورد نظر ما را به داخل هسته هدایت کند.
پپتید دوگانه دوست مدل MAP
این پپتید ساختگی با توالی KLALKLALKALKAALKLA می تواند با دو فرایند وابسته به انرژی و مستقل از انرژی وارد سیتوپلاسم شده و به همراه خود ملکول های مختلفی را وارد سازد. از نظر سرعت انتقال، بالاترین سرعت انتقال و همچنین بالاترین بازده انتقال را در بین CCP ها دارا است.
سایر پروتئین های نفوذ کننده به سلول
تعداد زیادی از پپتید های نفوذ کننده به سلول تا به حال شناسایی شده اند که برخی با مکانیسم مشخص و برخی با مکانیسم های ناشناخته به درون سلول نفوذ می یابند که این نفوذ می تواند با صرف انرژی و یا بدون مصرف انرژی باشد. علاوه بر این با مطالعات وسیع دانشمندان در این زمینه هر روز شاهد نمونه های جدیدی از این دسته پپتید ها هستیم.
استفاده از CPPs برای انتقال مواد به درون سلول:
غشای سلولی در ذرات خود نسبت به بسیاری از مواد ناتراوا است و تنها به موادی اجازه ورود می دهد که در متابولیسم طبیعی سلول نقش دارند و این محدودیت ورود با بزرگتر شدن ملکولی که قصد وارد شدن به محوطه سلولی را دارد بیشتر می شود. از این رو یکی از مشکلات بزرگی که در برابر انتقال دارو وجود دارد، نحوه وارد شدن به سلول است و همانطور که گفته شد راهکارهای مختلفی در این زمینه استفاده شده است.
با توسعه تکنولوژی پروتئین ترانسداکشن، این تکنیک به یکی از بهترین روش های دارو رسانی تبدیل گشته و امروزه ما می توانیم انواع مواد به خصوص پروتئین ها را به دامنه وسیعی از سلول ها وارد نماییم و از این طریق به اهداف پژوهشی و یا درمانی خود دست پیدا کنیم. وارد کردن پروتئین های نشانه مانند پروتئین های فلورسنت نمونه ای از استفاده های تحقیقاتی این تکنولوژی است. از طرف دیگر مواردی چون انتقال پروتئین BMP به داخل سلولهای استخوان ساز و تحریک تولید استخوان با استفاده از TAT، تغییرات چرخه سلولی و جلوگیری از آپاپتوز سلول و استفاده از همین روش در جلوگیری از ایسکمی مغزی، استفاده در درمان دیابت با وارد نمودن آنزیم های دخیل در سنتز انسولین، وارد کردن رسپتور های کلسترول، آنزیم بتاگالاکتوزیداز و غیره موارد استفاده از این روش در درمان بیماری ها می باشند.
انتقال کاسپازهای سلولی، انتقال P53 از دیگر گزارش هایی است که در مورد این پروتئین موجود است.
یکی از مهمترین مزیت های این سیستم، انتقال پروتئین های با اندازه بزرگ است. در گزارشی در سال 2000 انتقال پروتئین های با اندازه بزرگتر از 100 کیلو دالتون گزارش شده است. در این میان تنها اندازه پروتئین، فاکتور ویژه نیست، بلکه بازده انتقال نیز از اهمیت خاصی برخوردار است. در یک پروژه تحقیقاتی، با مقایسه انتقال بتاگالاکتوزیداز به سلول با استفاده از اتصال به TAT و انتقال توسط ویروس ها، انتقال به روش TAT را با بازده 100 درصد و انتقال ویروسی را با بازده 30 درصد بیان نموده اند.
توانایی انتقال توسط PTD ها تنها محدود به پروتئین ها نمی شود، بلکه این دامین ها می توانند در انتقال دامنه وسیعی از مواد به درون سلول فعالیت کنند. به عنوان مثال اتصال سیکلوسپورین توسط لینکر حساس به pH به یک PTD توانایی انتقال این دارو از طریق پوست به داخل سلول را تا حد زیادی بالا برده است. بنابراین، اتصال داروها به PTDها می تواند در بسیاری از دارو های دیگر، جذب را در تمام نقاط بدن افزایش دهد. این تکنولوژی را همچنین می توان در انتقال نانو پارتیکل ها به درون سلول به کار بست. مشاهده شده که کنجوگه کردن نانوپارتیکل ها با این ساختارها می تواند بازده انتقال را بسیار بالا ببرد، تا جایی که در گزارشات تحقیقاتی این بازده انتقال تا 100 برابر افزایش گزارش شده است.
انتقال آنتی سنس RNA ها، انتقال لیپوزوم ها و انتقال PNA ها از دیگر گزارشاتی است که در زمینه عملکرد پروتئین ترانسداکشن دامین ها وجود دارد.
مکانیسم عمل PTD ها:
اگرچه مکانیسم انتقال به وسیله PTD ها از عرض غشا تا اندازه زیادی ناشناخته است، اما مطالعات بسیاری در شناسایی نیاز های فیزیک و شیمیایی کلیدی PTD ها انجام شده است. مشخص شده است که تغییر در توزیع آرژنین در میان PTD می تواند بازده عمل آن را افزایش دهد. پس از این یافته در مطالعات دیگر مشخص شد که پپتید های حاوی مقادیر بالای آرژنین می توانند از غشا عبور کنند و در سیتوپلاسم تجمع یابند و به علتی که این انتقال حتی در 4 درجه هم قابل انجام است، این فرایند از مکانیسم های سلولی مستقل می باشد. به طور کلی به نظر می رسد که بازده انتقال به تعداد و محل قرارگیری باقی مانده های آرژنین در توالی مورد نظر بستگی دارد. علاوه بر این جایگزین کردن اسید آمینه های بدون بار تاثیر چندانی بر کارایی PTD ندارد. اما جایگزین کردن اسید آمینه بازی می تواند کارایی انتقال را کاهش دهد. همچنین ایزومر D از آرژنین کارایی بسیار بیستری از ایزومر L آن دارد. مطالعات بیشتر در زمینه اثر آرژنین در انتقال این فرضیه را ایجاد نمود که گروه گوانیدین از آرژنین توانایی بالایی در اتصال به بخش های باردار سطح سلول از قبیل سولفات ها و فسفات ها داشته و تفاوت آن با 2 اسید آمینه هیستیدین و لیزین در ایجاد پیوند های هیدروژنی ما بین گروه گوانیدین و یونهای باردار سطح سلول است.
تحقیقات نشان داده است که هپارین می تواند از ورود TAT به سلول جلوگیری کند. این امر فرضیه رقابت بین TAT و هپارین را ایجاد نموده و در نهایت باعث جلب نظر دانشمندان به سمت رسپتورهای هپارین به عنوان جایگاهی برای اتصال TAT گردیده است. پس از بدست آمدن این اطلاعات، با بررسی سلول های معیوب در سنتز پروتئو گلیکان های هپارین سولفات ، مشاهده گردید که این سلولها به TAT نفوذ ناپذیرند و عدم ورود TAT به این سلولها تایید دیگری بر نقش HS ها در ورود TAT به داخل سلول شد. البته بایستی به این مورد توجه داشت که انتقال سایر PTD ها می تواند متفاوت و یا شبیه TAT باشد. به عنوان مثال ANTP میتواند از عرض غشای دو لایه لیپیدی خالص نیز عبور نماید.
برخی مطالعات بیان نموده اند که TAT به واسطه آندوسیتوز وارد سلول می شود و تنها عمل PTD در این حالت اتصال محکم پروتئین به سطح سلول است به حالتی که سلول را تحریک به آندوسیتوز می کند. البته مکانیسم عملکرد در TAT مورد توافق ترین مکانیسم عملکردی در بین PTD ها است و در مورد سایر موارد اطلاعات بسیار متناقض و نامشخصی موجود است که این اطلاعات حاکی از عدم شناخت درست از عملکرد این ساختارها است.
مهندسی پروتئین های گذرنده از غشا:
همان طور که گفته شد برای انتقال پروتئین ها به درون سلول می توان آنها را به توالی های PTD متصل نمود و از این طریق داخل شدن پروتئین به داخل سلول باکارایی بسیار بالا انجام خواهد شد. معروفترین این توالی ها نیز توالی ها نیز TAT است که در بخش های پیشین در مورد آن توضیح داده شد.
توالی های غنی از آرژنین مهمترین عامل در انتقال توسط PTDها هستند و این توالی ها دارای خاصیت اتصال به ذرات با بار منفی هستند از این رو این نگرانی وجود دارد که این توالی ها درون سلول به ساختارهای با بار منفی بالا مانند DNA، RNA، پلی سالیسیلیک اسید ها، سطوح دولایه های فسفو لپیدی و غیره متصل شده و در عملکرد طبیعی آنها اختلال ایجاد کنند. به همین دلیل بایستی در استفاده از PTD ها بررسی های بیشتری انجام شود. از این رو بدست آوردن PTD هایی که از نظر بیولوژیک بی خطر باشند یکی از برنامه های تحقیقاتی در زمینه پروتئین ترانسداکشن است.
PTD ها به طور معمول به 2 روش به پروتئین ها اضافه می شوند
- اضافه کردن ژن PTD به پروتئین مورد نظر و بیان PTD به همراه پروتئین
- سنتز مصنوعی پروتئین با استفاده از تکنیک سنتز در بستر جامد و سپس اتصال به پروتئین هدف
در صورتی که اتصال بین PTD به صورت کوالان باشد احتمال اینکه واکنش PTD در سلول باعث گمراه شدن پروتئین هدف از مقصد اصلی خود شود را به وجود می آورد که استفاده از پیوند دی سولفید به جای کووالان توانسته این مشکل را رفع نماید. در این روش حامل و حمل شونده به محض ورود به سلول از یکدیگر جدا شده و هر یک می توانند به هدف خود متصل شوند.
به طور کلی برای ایجاد پیوند دی سولفید دو جزء متصل شونده بایستی دارای دو اسید آمینه سیستئین باشند. در مرحله بعد بایستی یکی از این دو اسید آمینه به واسطه ترکیبی مانند 5-nitropyridine فعال گشته و این فعال سازی باعث اتصال این دو به یکدیگر می شود. اما سنتز و خالص سازی پروتئین متصل به PTD بسیار سخت و طاقت فرسا بوده و بازده بسیار پایینی دارد.
مقدمه:
غشای سلولی در حالت کلی به بسیاری از مواد و ساختارهای خارجی نفوذ ناپذیر است و نتها تعداد محدودی از ساختار های کوچک می توانند به درون سلول نفوذ یابند. از این رو در علم دارو رسانی، یافتن راهی برای وارد ساختن دارو به سلول و یا اندامک های سلولی یکی از موانع راه توسعه داروها به شمار می رود. از سوی دیگر ساخت پروتئین درمانی در درون سلول نیاز به سیستم های پیچیده مهندسی ژنتیک و ژن درمانی داشته درنتیجه بهترین روش برای درمان، سنتز پروتئین در خارج سلول و وارد سازی آن به سلول بیمار است.
در راستای دست یابی به اهداف درون سلولی، روش هایی نیز ابداع گردیده که به علت برخی از نارسایی ها، یافتن راه جدیدی در ورود به سلول می تواند نقطه عطفی در علوم درمانی و دارویی باشد. هدف اصلی در این سیستم ها، رساندن ترکیباتی است که به سادگی نمی توانند به سلول وارد شوند (مانند DNA) و استفاده درمانی از این ترکیبات است. به همین منظور روشهایی چون تحریک آندوسیتوز، الکتروپوریشن، میکرواینجکشن، لیپوزوم ها و بسیاری از روش های دیگر به کار گرفته می شوند. اما این روش ها دارای محدودیت های بسیار زیادی هستند. در استفاده از تحریک اندوسیتوز، پس از ورود ترکیب مورد نظر به درون لیزوزوم، این ترکیب در معرض آنزیم ها قرار می گیرد، که در صورت حساسیت، داروی مورد نظر ما کارایی خود را از دست خواهد داد. از سوی دیگر روش هایی چون الکتروپوریشن و میکرواینجکشن علاوه بر محدودیت کاربرد، به ساختار سلول نیز آسیب وارد می کنند و ممکن است موجب تخریب سلول شوند. روش استفاده از لیپوروم ها نیز به علت حساسیت و تخریب پذیری از بازده کاری مناسبی برخوردار نیست.
با کشف پپتید های نفوذ کننده به درون سلول، راه تازه ای در رساندن دارو به درون سلول به وجود آمده و این سیستم توانسته با بازده بالا، سمیت کم و انعطاف پذیری بالا، مواد مورد نظر را به درون سلول وارد نماید. پپتید های نفوذ کننده به درون سلول (CPPs)، دامین های ترانداکشن پروتئینی (PTD)، پپتید های تروجان و پپتید های گذرنده از غشا، نام هایی است که بر این دسته از دسته از پروتئین ها می گذارند.
مقالات اخیر نشان داده است که PTD ها می توانند دامنه وسیعی از ملکول های فعال بیولوژیک مانند پروتئین ها، اولیگونوکلئوتید ها و نانو پارتیکل ها را به دامنه وسیعی از سلول ها در موجود زنده و یا در شرایط آزمایشگاهی منتقل نمایند.
PTD ها شامل دسته وسیعی از توالی های پروتئینی هستند که از نظر ساختاری، بار الکتریکی و ترکیب آمینو اسید ها بسیار متنوع هستند. تنها تشابه این گروه توانایی وارد شدن به سیتوپلاسم و هسته سلول ها است. در سال 1998، Green و همکارانش برای اولین بار نشان دادند که پروتئین TAT از ویروس HIV می تواند از غشای سلول عبور کرده و به درون سیتوپلاسم برود. در سال 1994 گروه دیگری از دانشمندان نشان دادند که توالی 16 آمینو اسیدیدر یکی از عوامل رونویسی در مگس سرکه به نام Antennapedia (Antp) و پروتئین VP22 در هرپس ویروس نیز خاصیت عبور از غشا را دارا هستند. در جدول زیر توالی و منشا تعدادی از این پپتید ها به طور خلاصه آورده شده است.
پپتید های نفوذ کننده به سلول CPPs:
نام اختصاری CPPs بهترین نامی است که می توان به پپتید هایی که توانایی وارد شدن به سلول را دارا هستند، اختصاص داد. به طور کلی این پروتئین ها را به 2 دسته تقسیم می کنند:
1- پپتید های حلقوی دو گانه دوست
2- پپتید های غنی از آرژنین
تا به حال CCPs های گوناگونی شناخته شده است که معروف ترین و شناخته شده ترین آنها عبارت اند از TAT، Antp، VP22، Transportan، MAP که در ادامه به بررسی جداگانه هر یک از این توالی ها پرداخته خواهد شد.
پروتئین TAT در ویروس ایدز:
TAT یک فعال کننده رونویسی در ویروس HIV است که دارای 86 آمینو اسید بوده و دارای بخش غنی از آمینو اسید سیستئین و یک بخش بسیار بازی 9 آمینو اسیدی که از 2 لیزین و 6 آرژنین یک آمینواسیدی دیگر تشکیل شده است و علاوه بر این دارای یک بخش متصل شونده به RNA می باشد.
این پروتئین توسط دو اگزون کد می شود که اگزون ابتدایی بخش 72 اسید آمینه ای انتهای آمینوپروتئین را کد می کند و برای فعالیت ، فعال کنندگی رونویسی در این پروتئین کافی است. مشاهده شده که در صورتی که این پروتئین را در محیط کشت سلولی قرار دهند، پروتئین می تواند وارد سلول شده و مستقیما به داخل هسته سلول برود.
مطالعات مختلف رسپتور های متفاوتی را برای TAT در سطح سلول بیان نموده اند مانند اینتگرین 90 کیلو دالتونی در سطح سلول و یا نوع دیگری از اینتگرین ها به نام avh5.
توالی مربوط به ورود به سلول که به ترانس داکشن دامین معروف است توالی آمینو اسیدی با توالی Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg است که پپتید را در ورود به سلول یاری می کند. همراه با این توالی یک توالی NLS (توالی هدایت کننده به هسته) نیز مسئول ورود پپتید به درون هسته می باشد.
بخش homeodomain از پروتئین Antennapedia
هموپروتئین ها دسته ای از فاکتور های رونویسی هستند که می توانند از طریق توالی خاص 60 آمینواسیدی به نام همودامین به DNA متصل شوند. همودامین از 3 هلیکس تشکیل شده است که هلیکس شماره 3 به هلیکس شناسایی معروف است. این هلیکس مسئول اتصال به محل اختصاصی بر روی DNA است. در مطالعه ای در زمینه شناخت اثر این پروتئین ها بر روی نمو سلولهای عصبی، مشخص شد که همو دامین از Antennapedia از مگس سرکه می تواند وارد سلولهای انسانی شده، مستقیما به طرف هسته رفته و تغییراتی در این سلولها ایجاد نماید.
مطالعات بیشتر مشخص نمود که هلیکس شماره 3 مسئول این انتقال بوده و دامین اختصاصی انتقال که penetratin نامیده شد، توالی 16 آمینو اسیدی با توالی Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys است.
پروتئین VP22 در ویروس هرپس تیپ 1
VP22 یکی از مهمترین بخش های HSV-1 است که توانایی ویژه ای در ورود به سلول را دارد. این پروتئین در سلولی که در آن تولید شده در سیتوپلاسم و در مجاورت میکروتوبولها قرار می گیرد، اما در صورتی که وارد سلولهای دیگر شود به درون هسته رفته و در مجاورت کروماتین ها قرار می گبرد.
ترانسپورتین
یک پروتئین ترکیبی است به طول 27 آمبنواسید که از اتصال نروپپتید Galanin به پروتئین واکنش دهنده با غشا به نام Mastoparan تشکیل شده است که می تواند ملکول مورد نظر ما را به داخل هسته هدایت کند.
پپتید دوگانه دوست مدل MAP
این پپتید ساختگی با توالی KLALKLALKALKAALKLA می تواند با دو فرایند وابسته به انرژی و مستقل از انرژی وارد سیتوپلاسم شده و به همراه خود ملکول های مختلفی را وارد سازد. از نظر سرعت انتقال، بالاترین سرعت انتقال و همچنین بالاترین بازده انتقال را در بین CCP ها دارا است.
سایر پروتئین های نفوذ کننده به سلول
تعداد زیادی از پپتید های نفوذ کننده به سلول تا به حال شناسایی شده اند که برخی با مکانیسم مشخص و برخی با مکانیسم های ناشناخته به درون سلول نفوذ می یابند که این نفوذ می تواند با صرف انرژی و یا بدون مصرف انرژی باشد. علاوه بر این با مطالعات وسیع دانشمندان در این زمینه هر روز شاهد نمونه های جدیدی از این دسته پپتید ها هستیم.
استفاده از CPPs برای انتقال مواد به درون سلول:
غشای سلولی در ذرات خود نسبت به بسیاری از مواد ناتراوا است و تنها به موادی اجازه ورود می دهد که در متابولیسم طبیعی سلول نقش دارند و این محدودیت ورود با بزرگتر شدن ملکولی که قصد وارد شدن به محوطه سلولی را دارد بیشتر می شود. از این رو یکی از مشکلات بزرگی که در برابر انتقال دارو وجود دارد، نحوه وارد شدن به سلول است و همانطور که گفته شد راهکارهای مختلفی در این زمینه استفاده شده است.
با توسعه تکنولوژی پروتئین ترانسداکشن، این تکنیک به یکی از بهترین روش های دارو رسانی تبدیل گشته و امروزه ما می توانیم انواع مواد به خصوص پروتئین ها را به دامنه وسیعی از سلول ها وارد نماییم و از این طریق به اهداف پژوهشی و یا درمانی خود دست پیدا کنیم. وارد کردن پروتئین های نشانه مانند پروتئین های فلورسنت نمونه ای از استفاده های تحقیقاتی این تکنولوژی است. از طرف دیگر مواردی چون انتقال پروتئین BMP به داخل سلولهای استخوان ساز و تحریک تولید استخوان با استفاده از TAT، تغییرات چرخه سلولی و جلوگیری از آپاپتوز سلول و استفاده از همین روش در جلوگیری از ایسکمی مغزی، استفاده در درمان دیابت با وارد نمودن آنزیم های دخیل در سنتز انسولین، وارد کردن رسپتور های کلسترول، آنزیم بتاگالاکتوزیداز و غیره موارد استفاده از این روش در درمان بیماری ها می باشند.
انتقال کاسپازهای سلولی، انتقال P53 از دیگر گزارش هایی است که در مورد این پروتئین موجود است.
یکی از مهمترین مزیت های این سیستم، انتقال پروتئین های با اندازه بزرگ است. در گزارشی در سال 2000 انتقال پروتئین های با اندازه بزرگتر از 100 کیلو دالتون گزارش شده است. در این میان تنها اندازه پروتئین، فاکتور ویژه نیست، بلکه بازده انتقال نیز از اهمیت خاصی برخوردار است. در یک پروژه تحقیقاتی، با مقایسه انتقال بتاگالاکتوزیداز به سلول با استفاده از اتصال به TAT و انتقال توسط ویروس ها، انتقال به روش TAT را با بازده 100 درصد و انتقال ویروسی را با بازده 30 درصد بیان نموده اند.
توانایی انتقال توسط PTD ها تنها محدود به پروتئین ها نمی شود، بلکه این دامین ها می توانند در انتقال دامنه وسیعی از مواد به درون سلول فعالیت کنند. به عنوان مثال اتصال سیکلوسپورین توسط لینکر حساس به pH به یک PTD توانایی انتقال این دارو از طریق پوست به داخل سلول را تا حد زیادی بالا برده است. بنابراین، اتصال داروها به PTDها می تواند در بسیاری از دارو های دیگر، جذب را در تمام نقاط بدن افزایش دهد. این تکنولوژی را همچنین می توان در انتقال نانو پارتیکل ها به درون سلول به کار بست. مشاهده شده که کنجوگه کردن نانوپارتیکل ها با این ساختارها می تواند بازده انتقال را بسیار بالا ببرد، تا جایی که در گزارشات تحقیقاتی این بازده انتقال تا 100 برابر افزایش گزارش شده است.
انتقال آنتی سنس RNA ها، انتقال لیپوزوم ها و انتقال PNA ها از دیگر گزارشاتی است که در زمینه عملکرد پروتئین ترانسداکشن دامین ها وجود دارد.
مکانیسم عمل PTD ها:
اگرچه مکانیسم انتقال به وسیله PTD ها از عرض غشا تا اندازه زیادی ناشناخته است، اما مطالعات بسیاری در شناسایی نیاز های فیزیک و شیمیایی کلیدی PTD ها انجام شده است. مشخص شده است که تغییر در توزیع آرژنین در میان PTD می تواند بازده عمل آن را افزایش دهد. پس از این یافته در مطالعات دیگر مشخص شد که پپتید های حاوی مقادیر بالای آرژنین می توانند از غشا عبور کنند و در سیتوپلاسم تجمع یابند و به علتی که این انتقال حتی در 4 درجه هم قابل انجام است، این فرایند از مکانیسم های سلولی مستقل می باشد. به طور کلی به نظر می رسد که بازده انتقال به تعداد و محل قرارگیری باقی مانده های آرژنین در توالی مورد نظر بستگی دارد. علاوه بر این جایگزین کردن اسید آمینه های بدون بار تاثیر چندانی بر کارایی PTD ندارد. اما جایگزین کردن اسید آمینه بازی می تواند کارایی انتقال را کاهش دهد. همچنین ایزومر D از آرژنین کارایی بسیار بیستری از ایزومر L آن دارد. مطالعات بیشتر در زمینه اثر آرژنین در انتقال این فرضیه را ایجاد نمود که گروه گوانیدین از آرژنین توانایی بالایی در اتصال به بخش های باردار سطح سلول از قبیل سولفات ها و فسفات ها داشته و تفاوت آن با 2 اسید آمینه هیستیدین و لیزین در ایجاد پیوند های هیدروژنی ما بین گروه گوانیدین و یونهای باردار سطح سلول است.
تحقیقات نشان داده است که هپارین می تواند از ورود TAT به سلول جلوگیری کند. این امر فرضیه رقابت بین TAT و هپارین را ایجاد نموده و در نهایت باعث جلب نظر دانشمندان به سمت رسپتورهای هپارین به عنوان جایگاهی برای اتصال TAT گردیده است. پس از بدست آمدن این اطلاعات، با بررسی سلول های معیوب در سنتز پروتئو گلیکان های هپارین سولفات ، مشاهده گردید که این سلولها به TAT نفوذ ناپذیرند و عدم ورود TAT به این سلولها تایید دیگری بر نقش HS ها در ورود TAT به داخل سلول شد. البته بایستی به این مورد توجه داشت که انتقال سایر PTD ها می تواند متفاوت و یا شبیه TAT باشد. به عنوان مثال ANTP میتواند از عرض غشای دو لایه لیپیدی خالص نیز عبور نماید.
برخی مطالعات بیان نموده اند که TAT به واسطه آندوسیتوز وارد سلول می شود و تنها عمل PTD در این حالت اتصال محکم پروتئین به سطح سلول است به حالتی که سلول را تحریک به آندوسیتوز می کند. البته مکانیسم عملکرد در TAT مورد توافق ترین مکانیسم عملکردی در بین PTD ها است و در مورد سایر موارد اطلاعات بسیار متناقض و نامشخصی موجود است که این اطلاعات حاکی از عدم شناخت درست از عملکرد این ساختارها است.
مهندسی پروتئین های گذرنده از غشا:
همان طور که گفته شد برای انتقال پروتئین ها به درون سلول می توان آنها را به توالی های PTD متصل نمود و از این طریق داخل شدن پروتئین به داخل سلول باکارایی بسیار بالا انجام خواهد شد. معروفترین این توالی ها نیز توالی ها نیز TAT است که در بخش های پیشین در مورد آن توضیح داده شد.
توالی های غنی از آرژنین مهمترین عامل در انتقال توسط PTDها هستند و این توالی ها دارای خاصیت اتصال به ذرات با بار منفی هستند از این رو این نگرانی وجود دارد که این توالی ها درون سلول به ساختارهای با بار منفی بالا مانند DNA، RNA، پلی سالیسیلیک اسید ها، سطوح دولایه های فسفو لپیدی و غیره متصل شده و در عملکرد طبیعی آنها اختلال ایجاد کنند. به همین دلیل بایستی در استفاده از PTD ها بررسی های بیشتری انجام شود. از این رو بدست آوردن PTD هایی که از نظر بیولوژیک بی خطر باشند یکی از برنامه های تحقیقاتی در زمینه پروتئین ترانسداکشن است.
PTD ها به طور معمول به 2 روش به پروتئین ها اضافه می شوند
- اضافه کردن ژن PTD به پروتئین مورد نظر و بیان PTD به همراه پروتئین
- سنتز مصنوعی پروتئین با استفاده از تکنیک سنتز در بستر جامد و سپس اتصال به پروتئین هدف
در صورتی که اتصال بین PTD به صورت کوالان باشد احتمال اینکه واکنش PTD در سلول باعث گمراه شدن پروتئین هدف از مقصد اصلی خود شود را به وجود می آورد که استفاده از پیوند دی سولفید به جای کووالان توانسته این مشکل را رفع نماید. در این روش حامل و حمل شونده به محض ورود به سلول از یکدیگر جدا شده و هر یک می توانند به هدف خود متصل شوند.
به طور کلی برای ایجاد پیوند دی سولفید دو جزء متصل شونده بایستی دارای دو اسید آمینه سیستئین باشند. در مرحله بعد بایستی یکی از این دو اسید آمینه به واسطه ترکیبی مانند 5-nitropyridine فعال گشته و این فعال سازی باعث اتصال این دو به یکدیگر می شود. اما سنتز و خالص سازی پروتئین متصل به PTD بسیار سخت و طاقت فرسا بوده و بازده بسیار پایینی دارد.