آشنایی باتکنیک های بیوشیمیایی

[سید لفته فردزاده]

فتومتری:
طبق قانون بیر-لامبرت، میزان نور جذب شده (A) توسط یک محلول با جذب مولی (a)، طول مسیر عبور نور از محلول (b) و غلظت محلول (c) متناسب است. میزان جذب نور را می توان از رابطه A = 2 - Log T% به دست می آید. (Tبرابر با میزان نور عبور نموده است).
اجزای فتومتر:
منبع نور:
در اسپکتروفتومتری معمولا از طیف مرئی (طول موج حدود 700-350 نانومتر) یا طیف فرابنفش (طول موج حدود 350-200 نانومتر) استفاده می شود. برای اندازه گیری در طیف مرئی معمولا از لامپ تنگستن و برای اندازه گیری در طیف ماوراء بنفش از لامپ های هیدروژنی، جیوه ای یا دوتریومی استفاده می شود.
تک رنگ ساز (منوکروماتور):
در فیلتر فتومتری از یک فیلتر که اجازه
عبور تنها یک طول موج را می دهد. در اسپکتروفتومتری از
یک منشور که طیف نوری با طول موج های مختلف ایجاد می کند به عنوان تک رنگ ساز
استفاده می شود. منشور نور در دامنه
فرابنفش را بسیار خوب تکفیک می کند، زیرا در طول موج های با دامنه پایین، شکست نور
بیشتری حاصل می شود.
آشکارساز (دتکتور):
به دو شکل فتوولتتیک و فتوتیوب (فتوسل) وجود
دارد. فتومولتی پلیر (PMP) یک نوع پیشرفته فتوتیوب است که به عنوان آشکارساز مورد استفاده
قرار می گیرد.
در اسپکتروفتومتری دو پرتویی از یک پره
دوار که شامل یک آیینه گردان است که به صورت متناوب نور را از درون کووت های نمونه
و مرجع عبور می دهد. هماهنگی پره های دوار و آیینه ها به گونه ای است که پرتو نور
قبل از رسیدن به نورسنج با هم ترکیب می کنند. نورسنج با تولید یک موج یکنواخت نسبت
سیگنال های نمونه و مرجع را نشان می دهد.
فلیم فتومتری:
اتم های بسیاری از عناصر فلزی بعد از
دریافت مقادیر کافی انرژی به شکل انرژی حرارتی، می توانند انرژی به دست آمده را به
شکل امواج نورانی با طول موج مختص آن عنصر نشر دهند. اساس این فرایند برانگیختن
اتم فلزات قلیایی با استفاده از انرژی شعله آتش می باشد که به واسطه آن الکترون
های مدار آخر به مدار بالاتر رفته و ایجاد اتم های برانگیخته می نمایند. در هنگام بازگشت
این الکترون ها به مدار اولیه خود، انرژی جذب شده به صورت انرژی نورانی نشر می
یابد. مقدار نور نشر شده متناسب با غلظت نمونه است که با دستگاه فلیم فتومتر قابل
اندازه گیری است. از این روش می توان برای اندازه گیری یون های فلزات قلیایی مانند
سدیم، پتاسیم، لیتیم و سزیم استفاده کرد.
اسپکتروفتومتری جذب اتمی (AAS):
مقدار نور جذب شده به وسیله اتم های غیر
برانگیخته موجود در شعله، متناسب با غلظت نمونه است که با اسپکتروفتومتر جذب اتمی
قابل اندازه گیری است.
اجرای اسپکتروفتومتر جذب اتمی:
منبع نور:
در جذب اتمی نیاز به لامپ حاوی کاتد از
جنس عنصر مورد نظر می باشد. برای این منظور می توان از لامپ هالوکاتد استفاده کرد
که در آن، کاتد از جنس فلز مورد نظر و آند، تنگستن می باشد. اگرچه کاتدهایی وجود
دارند که از جنس چند عنصر تشکیل شده اند، معمولا یک لامپ مجزا برای تعیین هر عنصر
وجود دارد. گاز موجود در لامپ هلیوم-نئون یا آرگون
است. ابتدا گاز موجود در لامپ یونیزه شده و
برخورد کاتیون های گاز به کاتد باعث خارج شدن اتم های آن عنصر می گردد. برخورد این اتم ها با ذرات گاز باعث تهییج و انتشار نور از آن ها می
شود.
اتمایزر:
اتمایزر اسپکتروفتومتر جذب اتمی شامل یک
نبولایزر و کوره شعله یا گرافیت است. نبولایزر نمونه را به حالت یکنواخت به درون
شعله پخش می کند.
اسپکتروفتومتری جذب اتمی می توان برای
اندازه گیری کلسیم، منیزیم، روی، منگنز و برخی دیگر از عناصر استفاده کرد. جهت
جلوگیری از تداخلات شیمیایی به واسطه آنیون هایی چون فسفات و سولفات می توان نمونه
را با محلول لانتانیوم رقیق کرد. لانتانیوم با یون های
فسفات و سولفات پیوند محکم برقرار می کند.
در اسپکتروفتومتری جذب اتمی بدون شعله
از لوله توخالی گرافیتی با انتهاهایی از جنس کوارتز استفاده می شود. لوله به وسیله
جریان گرم شده تا نمونه به حالت دوده درآید و آرگون به درون لوله موئینه تزریق شده
تا اتم ها پخش شوند. کوره نسبت به اتمایزر
شعله حساس تر بوده و کارایی آن در به حالت اتم درآوردن نمک های مقاوم به حرارت
بیشتر است، ولی مستعد تداخل زمینه ای بیشتری بوده و عملکرد آن کندتر از اتمایزر
شعله ای است، زیرا قبل از تزریق نمونه بعدی باید خنک شود. از اسپکتروفتومتری جذب
اتمی بدون شعله می توان جهت اندازه گیری کرومیوم استفاده کرد.
فلورومتری:
وقتی نور از میان یک محلول حاوی مولکول
ها و اتم های مختلف عبور می کند، بخشی از انرژی نورانی که توسط یک ماده فلورسنت
جذب شده است، به صورت نور با طول موج انرژی کمتر نشر می یابد که به طریق فلورومتری
اندازه گیری می شود. در یک فلورومتر، تک رنگ ساز اولیه، طول موج برای تهییج ماده
فلورسنت را عبور می دهد؛ و تک رنگ ساز ثانویه، طول موج منتشر شده به وسیله ماده
فلوروسنت به نورسنج را عبور می دهد.
یکی از مشکلات فلورومتری خاموش شدن (Quenching) می باشد که اشاره به کاهش شدت فلورسانس به واسطه تعامل با حلال
یا اجزاء موجود در حلال دارد. افزایش دما منجر به بیشتر شدن برخورد تصادفی بین مولکول ها به
وسیله افزایش تحرک آن ها می شود. در نتیجه انرژی به جای فلورسانس به صورت گرما
منتشر می شود.
نفلومتری:
در این روش نور تفرق یافته توسط ذرات
معلق موجود در یک محلول اندازه گیری شده که با غلظت ترکیب مورد نظر متناسب می
باشد. در نفلومترها، نورسنج ها بسته به کاربرد
آن ها معمولا بین زاویه 25 درجه و 90 درجه نسبت به نور قرار دارند. با تقویت نور
خروجی نورسنج با استفاده از لامپ حساس به نور مرکب می توان حساسیت را تا هزار
برابر افزایش داد. در لامپ حساس به نور مرکب از دی نود (Dynode) های افزایش دهنده ولتاژ برای تقویت جریان حاصل از کاتد حساس به
نور استفاده می شود.
سانتریفوژ:
انواع سانتریفوژ بر اساس سرعت:
معمولی: تا 20000 دور در دقیقه
سرعت بالا: با 25000-20000 دور در دقیقه
اولترا سانتریفوژ: بالاتر از 25000 دور
در دقیقه
فرمول نیروی نسبی سانتریفوژ (RCF) یا گراویتی (g):
سانتریفوژ افتراقی:
در این روش جداسازی اجزای مختلف بر اساس
شکل و اندازه آن ها صورت می گیرد و اجزایی که از این لحاظ با هم اختلاف دارند قابل
جداسازی هستند. در سانتریفوژ افتراقی جهت جداسازی اجزاء سلول، با افزایش سرعت به
ترتیب هسته و داربست سلولی، میتوکندری، لیزوزوم و پراکسی زوم، وزیکول ها و ریبوزم
ها جدا می شوند.
سانتریفوژ هم چگال:
در این روش اجزای مختلف بر حسب چگالی از
یکدیگر جدا می شوند. برای جداسازی پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک معمولا از
سانتریفوژ ناحیه ای یا شیبی یا هم چگال در لوله سانتریفوژ استفاده می شود. برای این منظور نسبت های متفاوت محلول کم-چگال با یک محلول
پر-چگال طوری مخلوط می شوند تا یک شیب خطی از غلظت ماده مورد نظر در بالا تا پایین
لوله ایجاد گردد. جهت جداسازی پروتئین
ها به این روش می توان از محلول سوکروز با غلظت های متفاوت 5% و 20% ، و برای
جداسازی اسیدهای نوکلئیک از محلول کلرید سزیم (CsCl) با غلظت های متفاوت استفاده کرد.
جهت سنجش سرعت سانتریفوژ از وسیله ای به
نام تاکومتر استفاده می شود که بر دو نوع معمولی و نوری وجود دارد.
کروماتوگرافی:
کروماتوگرافی جذبی:
در این نوع کروماتوگرافی که عمدتا برای
ترکیبات قطبی و غیر یونی مطرح می شود، جداسازی بر اساس میزان جذب سطحی مواد مختلف
صورت می پذیرد. در کروماتوگرافی جذبی به طور معمول از ژل های آلومینا و سیلیکا به
عنوان فاز ساکن (جاذب سطحی) استفاده می شوند.
کروماتوگرافی تقسیمی:
در این نوع کروماتوگرافی، جداسازی مواد
بر اساس حلالیت نسبی آن ها در یک حلال صورت می گیرد. این روش، شامل تکیه گاهی ثابت
از جنس سلولز یا سیلیکا است که توسط لایه مایعی به عنوان فاز ساکن پوشش داده می
شود. فاز متحرک نیز می تواند هر مایع انحلال ناپذیری در فاز ساکن باشد. جداسازی
اجزای نمونه بر مبنای سرعت حرکت آن ها در فاز ساکن صورت می پذیرد.
کروماتوگرافی کاغذی:
در این روش از کاغذ صافی به عنوان تکیه
گاهی ثابت برای نمونه استفاده می شود. در این نوع کروماتوگرافی، فاز ثابت لایه ای
از آب و یا یک حلال قطبی است که فیبرهای کاغذ را می پوشاند. جداسازی اجزای مخلوط
از یکدیگر به ضریب تفکیک آن ها در حلال بستگی دارد.
کروماتوگرافی لایه نازک (TLC):
در این روش، فاز ساکن لایه نازکی از
جاذبی سطحی (عموما ژل آلومینا یا سیلیکا) است که بر روی صفحه ای نازک کشیده شده
است و فاز متحرک، عبارت است از مایعی که در مسیر حرکت خود از میان فاز ساکن، نمونه
را نیز حمل می کند. اجزای نمونه بر اساس میزان جذب در فاز ساکن و انحلال پذیری در
فاز متحرک جداسازی می شوند. در این نوع کروماتوگرافی، لایه نازک جذب کننده، نظیر
آلومینا، سیلیکا ژل، سلولز یا دکستران با اتصالات عرضی به طور یکنواخت بر روی یک
صفحه شیشه ای یا پلاستیکی پخش شده است.
کروماتوگرافی غربال مولکولی:
در این نوع کروماتوگرافی، فاز جامد شامل
دانه های منفذداری است که مولکول ها را بر اساس اندازه جدا می کنند، بدین صورت که
مولکول های کوچک وارد منافذ شده و دیرتر از ستون خارج می شوند؛ و مولکول های بزرگ
وارد منافذ نشده و زودتر از ستون خارج می گردند. فاز ثابت می تواند از جنس
دکستران، پلی اکریلامید، آگاروز، پلی استیرن و یا سیلکا باشد.
کروماتوگرافی تعویض یونی:
در این نوع کروماتوگرافی فاز جامد تعویض
کننده یون، شامل یک پایه رزینی و گروه های عامل به آن متصل می باشد. این گروه های
عامل از یک سمت اتصال کووالان به پایه دارند و از سمت دیگر، از طریق جاذبه های
الکترواستاتیک با یون های مخالف موجود در فاز مایع ارتباط ضعیف برقرار می کنند.
این یون ها می توانند توسط یون های موجود در محلول جایگزین گردند. فاز ثابت می
تواند پلیمری از جنس استیرن دی وینیل بنزن، سفادکس یا سلولز باشد.
کروماتوگرافی میل ترکیبی:
در این نوع کروماتوگرافی، به فاز جامد
مولکول هایی به نام لیگاند (نظیر سوبسترا یا آنتی ژن) که تمایل بالایی برای اتصال
به ترکیبات دیگر (نظیر آنزیم یا آنتی بادی) متصل می شوند.
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC):
در HPLC، حلال های آلی باعث
جداسازی ترکیبات غیر قطبی و بعدا قطبی می شوند. در HPLC فاز معکوس، حلال های با قطبیت بیشتر باعث جداسازی ترکیبات قطبی و
در نهایت ترکیبات غیر قطبی می شوند. در HPLC فاز معکوس، تفکیک
با استفاده از یک جاذب غیر قطبی (فاز ثابت) مانند اکتادسیل سیلان (C18)
انجام می شود. مولکول های اکتادسیل سیلان به ذرات سیلیکاژل اتصال دارند. استونیتریل
به همراه متانول به عنوان اصلاح کننده قطبیت معمول برای HPLC به شمار می رود. در بیشتر تفکیک های داروها، هورمون ها، و
متابولیت های بالینی از فاز معکوس استفاده می شود، زیرا فازهای متحرک آبی سمیت و
قابلیت اشتعال به مراتب کمتری دارند.
در تکنیک HPLC با تشخیص الکتروشیمیایی (HPLC-ECD) از یک الکترود کربن شیشه ای و یک استاندارد کلرید نقره استفاده
می شود. با نگه داشتن الکترود کربن شیشه ای در ولتاژ مثبت (اکسیداسیون) یا ولتاژ
منفی (احیاء)، آنالیت اکسید یا احیاء می شود، جریان حاصل نسبت مستقیم با غلظت آنالیت
دارد. گروه های فنلی مانند کاتکول آمین ها را می توان با HPLC-ECD
اندازه گیری کرد.
فرمول میزان تفکیک دو ماده A و B در کروماتوگرافی:
برای افزایش بهبود جداسازی می توان سه
فاکتور زیر را تغییر داد:
فاکتور احتباسی (k):
مرتبط با توزیع مواد بین فازهای ثابت و متحرک می باشد. این فاکتور معیاری از
زمان باقیماندن اجزاء در فاز ثابت نسبت به فاز متحرک می باشد.
کارایی
ستون (N): مرتبط با سادگی تعامل بین مولکول های
حل شده و ماده موجود در ستون است و با کاهش انتشار باندها مشخص می گردد. کارایی اغلب بر اساس تعداد صفحات تئوری در هر واحد طول ستون یا
معادل ارتفاع یک صفحه تئوری (HETP) بیان می شود.
انتخابی بودن ستون (a):
تمایل شیمیایی اختصاصی بین مولکول های مواد حل شده و ماه موجود در ستون را مشخص می
کند. فاکتور انتخابی بودن معیاری از جداسازی
نسبی بین مراکز باندهای مربوط به دو ماده حل شده می باشد.
در عمل برای بهبود میزان تفکیک ابتدا
فاکتور احتباسی به میزان قابل قبول تغییر و سپس کارایی بهبود داده می شود. بالاخره در صورت نیاز میزان انتخابی بودن تغییر داده می شود.
گاز کروماتوگرافی (GC):
از گاز کروماتوگرافی برای جداسازی
مخلوطی از ترکیبات فرار استفاده می شود. گاز کروماتوگرافی ممکن است به دو شکل
کروماتوگرافی گاز-جامد (GSC) با فاز ثابت جامد، یا کروماتوگرافی
گاز-مایع (GLC) با یک فاز ثابت مایع غیر فرار انجام
شود.
انواع آشکارساز در گاز کروماتوگرافی:
آشکارساز یونیزاسیون شعله ای (FID):
بیشترین کاربرد را در آزمایشگاه های بالینی دارد. در یونیزاسیون شعله،
انرژی حاصل از یک شعله برای برانگیختن آنالیت های جدا شده از ستون استفاده می شود.
تولید شعله با سوختن مخلوط هیدروژن، گاز حامل و هوا، صورت می گیرد. با دفع الکترون
لایه بیرونی در آنالیت برانگیخته، جریان تولید می شود. گاز حامل ممکن است نیتروژن،
هلیوم و یا آرگون باشد.
آشکارساز یونیزاسیون نوری (PID):
شکلی از FID است که در آن انرژی یونیزاسیون توسط
لامپUV قوی به جای شعله فراهم می گردد.
آشکارساز انتقال حرارتی (TCD):
بر اساس تغییر هدایت حرارتی یک گاز در اثر افزودن یک ترکیب به آن عمل می کند.
الکتروفورز:
مراحل الکتروفورز بر روی استات سلولز:
رنگ آمیزی: با رنگ پانسوا S به مدت 10 دقیقه
رنگ بری: با اسید استیک 5% به مدت 10 دقیقه
شفاف سازی: با مخلوط اسید استیک و
متانول به مدت 1 دقیقه
الکتروفورز بر روی ژل پلی اکریلامید و
در حضور SDS (SDS-PAGE):
در این روش، جداسازی مواد بر اساس
اندازه و وزن مولکولی آن ها صورت می گیرد؛ به طوری که یک رابطه خطی بین میزان حرکت
و لگاریتم وزن مولکولی مواد وجود دارد. اگر یک دترجنت یونی به سیستم سنجش
الکتروفورز پروتئین افزوده شود و الکتروفورز در طول یک بستر منفذ دار انجام گردد،
جداسازی پروتئین ها بر اساس اندازه پروتئین خواهد بود و نه بار آن. دترجنت معمول، سدیم
دودسیل سولفات (SDS) و بستر منفذ دار معمول، پلی اکریلامید
دارای پیوندهای عرضی می باشد.
سرعت حرکت الکتروفورتیک مولکول ها با
بار خالص مولکول (z) و شدت میدان الکتریکی (اختلاف پتانسیل)
بستگی مستقیم و با ضریب اصطکاک (f) رابطه عکس دارد.
ضریب اصطکاک خود بستگی به جرم و شکل مولکول و ویسکوزیته محیط دارد. قدرت یونی بافر
نیز که خود رابطه مستقیم با غلظت یونی بافر و بار الکتریکی آن دارد، در میزان حرکت
الکتروفورتیک موثر می باشد. هر چه قدرت یونی بافر بیشتر باشد، حرکت پروتئین ها کند
تر صورت گرفته و جداسازی بهتر صورت می گیرد.
در ژل پلی اکریلامید رشته های موازی
اکریلامید توسط پل های عرضی N-Nمتیلن بیس اکریلامید به یکدیگر اتصال
دارند. پلیمریزاسیون اکریلامید یک واکنش
رادیکالی است که ممکن است به طریق شیمیایی توسط آمونیوم پر سولفات شروع شود. در این روش TEMED به
عنوان کاتالیزور عمل می کند.
جهت تعیین مقدار اجزاء باندهای
الکتروفورتیک می توان از روش معمول چگالی سنجی یا دانسیتومتری استفاده کرد. در روش
دیگر، رنگ موجود در هر باند شستشو (Elution) داده شده و سپس میزان
رنگ خارج شده به طریق اسپکتروفتومتری اندازه گیری می شود.
سیستم پیوسته و ناپیوسته
الکتروفورز:
تکنیک SDS-PAGE را همانند سایر
روش های الکتروفورز می توان در سیستم بافری پیوسته یا ناپیوسته انجام داد. در سیستم
پیوسته الکتروفورز، تمام بافرها و ژل‌های استفاده شده دارای pH و مولاریته یکسان
هستند و فقط یک لایه ژل وجود دارد در صورتی که در سیستم ناپیوسته الکتروفورز، در
ناپیوسته دو ژل وجود دارد: ژل پایین یا ژل تفکیک کننده (resolving gel) و ژل بالا یا ژل
متراکم کننده (stacking
gel). � � � �
بافری که برای تهیه ژل
ناپیوسته استفاده می‌شود از نظر مولاریته و pHژل پایین و
ژل بالا متفاوت می باشند. در ژل بالا (ژل متراکم کننده) غلظت اکریل آمید کمتر است
و منافذ آن بزرگ تر بوده ولی در ژل پایین (ژل تفکیک کننده) غلظت اکریل آمید زیاد
بوده و منافذ آن کوچک‌تر است. این سیستم موجب متراکم شدن باندهای پروتئین در ژل
بالا و تفکیک آن ها در ژل پایین از هم می شوند. الکتروفورز در سیستم بافری
ناپیوسته از نتیجه مطلوب تری برخوردار بوده، متأثر از حجم نمونه نیست. از طرف دیگر
اغلب پروتئین ها در حضور SDS،
واسرشته و به راحتی محلول می گردند، درنتیجه به طور معمول در سیستم بافری ناپیوسته
صورت می گیرد و انجام آن در سیستم بافری پیوسته به ندرت دیده می شود.
الکتروفورز دو بعدی (2-D):
در الکتروفورز دو بعدی، ابتدا تفکیک بر اساس تفاوت PH ایزوالکتریک
(PI) صورت می پذیرد، سپس ژل را 90 درجه چرخانده وSDS و بافر افزوده شده و تفکیک دوباره بر اساس وزن
مولکولی انجام می گیرد.
الکترواندوسمز: آگاروز و استات سلولز
حاوی آنیون های ثابت شده ای مانند استات هستند که به هنگام
آغشته شدن با بافر کاتیون ها را جذب می کنند. با برقرار شدن ولتاژ
کاتیون ها به سوی کاتد مهاجرت کرده و نیروی اسموتیک ایجاد شده باعث کشیده شدن آب
با یون ها می شود. این نیرو به نام
الکترواندوسمز خلاف جریان حرکت پروتئین ها به سوی آند عمل می کند و می تواند باعث
جابه جایی گاماگلوبولین ها به سوی کاتد شود.
ایمونوالکتروفورز:
یک روش کیفی برای تعیین حضور یک آنتی ژن
می باشد. نمونه سرم ابتدا الکتروفورز شده و سپس جزء آنتی ژنی سرم با آنتی بادی
اختصاصی خود در ژل رسوب می دهد.
راکت ایمونوالکتروفورز:
یک روش کمی برای سنجش یک آنتی ژن می
باشد. نمونه سرم بر روی ژل حاوی آنتی بادی اختصاصی الکتروفورز می شود. رسوب تشکیل
شده میان آنتی ژن و آنتی بادی شکلی شبیه به راکت دارد که ارتفاع آن متناسب با غلظت
آنتی ژن درون چاهک است.
الکتروفورز ایمونوفیکساسیون (IFE):
از این روش می توان جهت تشخیص آنتی بادی
های منوکلونال موجود در الکتروفورز پروتئین ها استفاده کرد. ابتدا الکتروفورز بر
روی ژل انجام شده و سپس آنتی بادی های اختصاصی به پروتئین های جدا شده اضافه می
گردد. این آنتی بادی ها با اتصال به به آنتی ژن های پروتئینی مورد نظر، آن ها را
در داخل ژل ثابت می کنند. بعد از رنگ آمیزی، الگوهای حاصل هویت پروتئین های
منوکلونال را نشان می دهد.
زیموگرافی:
زیموگرافی در واقع نوع خاصی از SDS-PAGE است که در طی آن ژل پلی اکریلامید با
سوبسترای آنزیم کو-پلیمریزه شده و سپس الکتروفورز انجام می شود .به طور کلی روش زیموگرافی برای بررسی فعایت ماتریکس
متالوپروتئازهایی نظیر کلاژنازها و ژلاتینازها و همچنین فاکتورهای فعال کننده
پلاسمینوژن مورد استفاده قرار می گیرد. پس از اتمام کار،
محلول بافری حاوی آنزیم به ژل اضافه شده تا آنزیم در محل تجمع سوبسترا فعالیت
کاتالیتیک خود را شروع نماید. پس از رنگ آمیزی و
رنگ بری هاله های شفافی در محل تجمع سوبسترا ظاهر می شود که نشانگر فعالیت
پروتئولیتیک آنزیم بوده و به روش دانسیتومتری قابل اندازه گیری می باشد.
ایمونودیفیوژن:
این روش بر پایه رسوب کمپلکس ایمنی در
ژل استوار است. یکی از دو عامل آنتی
ژن و آنتی بادی در ژل انتشار یافته و درمکانی از ژل که غلظت این دو عامل به تعادل
می رسد، رسوب کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی در ژل قابل مشاهده می باشد. با اندازه گیری قطر حلقه رسوبی می توان غلظت آنتی ژن را به دست
آورد. از این روش می توان برای اندازه گیری میزان ایمونوگلوبولین ها،
اجزای کمپلمان و سایر پروتئین های پلاسما نظیرسرولوپلاسمین و ترانسفرین استفاده
کرد.
طیف سنجی فرابنفش (UV):
زنجیره های جانبی تیروزین، فنیل آلانین
و تریپتوفان و همچنین پیوندهای پپتیدی امواج فرابنفش (UV) را جذب می کنند. کارایی جذب هر ناحیه
کروموفور به ضریب خاموشی مولی آن بستگی دارد. جذب در ناحیه بین 260
تا 300 نانومتر عمدتا ناشی از زنجیره
های جانبی آروماتیک است. هنگامی که زنجیره
جانبی تیروزین در pH بالا یونیزه می شود جذب به طول موج
بالاتر شیفت پیدا کرده و جذب مولی افزایش می یابد.
طیف سنجی UV در
مورد ساختار دوم و سوم یک پروتئین اطلاعاتی به ما می دهد. همزمان با دناتوره
شدن یک پروتئین به خاطر تخریب سیستم تهییجی در ویژگی های جذبی پیوندهای پپتیدی
تفاوت هایی ایجاد می شود. به علاوه جذب ماکزیمم
یک ناحیه کروموفر آروماتیک در یک محیط آبی نسبت به یک محیط غیر قطبی در طول موج
پایین تری اتفاق می افتد. جذب مولار یک
سوبسترای کروموفر اغلب با اتصال به یک پروتئین تغییر کرده و می تواند برای اندازه
گیری ثابت اتصال استفاده شود.
طیف سنجی فلورسانس:
انرژی یک الکترون تحریک شده که توسط جذب
نور به وجود می آید در طی برخورد الکترون ها به هم به طور معمول به صورت انرژی
گرمایی از دست می رود. در برخی کروموفورها
مولکول های جذب کننده نور انرژی تحریکی به صورت
فلوروسانس از دست می رود. نشر فلورسانس در
مقایسه با طول موج جذبی فلوروفور با طول موج بلندتر (انرژی کمتر) روی می دهد، چون سطوح انرژی ارتعاشی شکل گرفته در طی جذب نور
(تحریک)، قبل از فلورسنت از بین می رود. نشانگرهای
فلوروسنت (فلوروکروم یا فلوروفورها) ترکیباتی هستند که
انرژی نورانی با یک طول موج را دریافت و انرژی نورانی با طول موج بالاتر را ظرف 0001/0
ثانیه نشر می دهند. در فسفرسانس این زمان از 0001/0 تا 100 ثانیه می
باشد.
طول موج های نشری فنیل آلانین با طول
موج های جذبی تیروزین هم پوشانی دارند. از سوی دیگر طول موج
های نشری تیروزین با طول موج های تریپتوفان هم پوشانی دارند. به علت چنین هم
پوشانی در طول موج های نشری و جذبی عمدتا فقط نشر فلورسانس تریپتوفان مشاهده می
شود.
لومینومتری:
نشانگرهای لومینسنت ترکیباتی هستند که
در طی یک واکنش الکتریکی، شیمیایی یا بیوشیمیایی انرژی نورانی آزاد می کنند. ترکیبات آلی در اثر اکسیداسیون در حضور پراکسید هیدروژن،
هیپوکلریت، اکسیژن و کاتالیتی نظیر پراکسیداز، آلکالین فسفاتاز و یون فلزی برانگیخته می شوند و در حین برگشت به حالت پایه، انرژی نورانی
آزاد می کنند. از جمله این مواد می
توان به لومینول که در حضور پراکسید و پراکسیداز تولید نور می کند، استرهای
آکریدینیوم که در حضور پراکسید هیدروژن، به ترکیب ناپایداری تبدیل می شوند که در
اثر انتشار نور به حالت پایدار می رسند؛ و همچنین نیتروفنیل اگزالات اشاره کرد.
اسپکترومتری جرمی (MS):
اسپکترومتری جرمی روش دقیقی برای تعیین
جرم مولکول های باردار است. مسیر حرکت مولکول های
باردار در میدان الکتریکی یا مغناطیسی تابعی از جرم به بار آن ها می باشد. از این روش می توان برای تعیین دقیق جرم مولکولی پروتئین ها و
پپتیدها، تعیین توالی اسید آمینه ای آن ها بر اساس جرم اسید آمینه و تغییرات پروتئین ها در اثر فسفریلاسیون، هیدروکسیلاسیون، و
یا متیلاسیون استفاده نمود. از اسپکترومتری جرمی
می توان برای اندازه گیری عناصر کمیاب نظیر آهن، مس، کبالت نیز استفاده کرد.
رزونانس مغناطیسی هسته (NMR):
برخی اتم ها دارای نوعی چرخش هسته ای
هستند که منجر به تولید سیگنالNMR می گردند. چرخش هسته ای سبب
تولید دو قطبی مغناطیسی می شود که در یک میدان مغناطیسی قوی قابل بررسی هستند. با استفاده از NMR
دو بعدی (2-D)
و طیف سنج های NMR توانمند می توان آرایش فضایی پروتئین
های کوچک در محلول را تعیین کرد. تفاوت اصلی بینNMR دو بعدی (2-D) و یک بعدی (1-D) افزایش یک
پالس rfتاخیری در زمان ثانویه است.
دورنگ سنجی دورانی (CD):
دو رنگ سنجی دورانی به علت اختلاف در
نور جذبی بین ترکیبات راستگرد و چپگرد، به هنگام عبور نور پلاریزه از درون محلولی
از یک مولکول فعال نوری مانند L-آمینو اسیدها، به
وجود می آید. اسیدهای آمینه آروماتیک در یک پروتئین و زنجیره پلی پپتیدی، طیف چرخش
نوری را به وجود می آورند. طیف نوری وقتی به وجود می آید که چرخش نوری یا
دونورسنجی دورانی از طریق گستره ای از طول موج ها تعیین شود. به علت تفاوت بین طیف
ساختاری آلفا-هلیکس و صفحات بتا و ساختارهای نامنظم، دونورسنجی دورانی یک روش حساس
برای تخمین مقدار و نوع ساختارهای دوم در پروتئین به شمار می رود.