کاوشگرها

[سید لفته فردزاده]

کاوشگر در واقع چیزی نیست مگر یک قطعه اسید نوکلئیک که پژوهشگر در نظر دارد از وجود آن در یک قطعه ژنوم یا توده dna مورد مطالعه اطلاع حاصل کرده و یا وقایع درون و پیرامون آن را بررسی کند. این قطعه اسید نوکلئیک در بیشتر موارد یک قطعه dna است که ممکن است ردیف آن شناخته شده یا مجهول باشد برای مثال چنانچه فردی مایل به بررسی و مطالعه ایزوفرم های مختلف یک ژن باشد ممکن است قطعه دی.ان.آیی را که به عنوان کاوشگر مورد استفاده قرار میدهد قطعه ای از ژن باشد که ردیف آن معلوم است. اما چنانچه هدف پژوهشگر تخمین فاصله ژنتیکی یا گروهبندی تعدادی از جانوران در حال انقراض مانند یوزپلنگ آسیایی باشد ممکن است هر قطعه دی.ان.آ از آن جانور یا گونه های نزدیک به آن جانور یا حتی دی.ان.آی ساختگی و تصادفی به عنوان کاوشگر مورد استفاده قرار گیرد. روشهای مختلفی برای تهیه کاوشگر وجود دارد. یکی از رایجترین روشهای تهیه کاوشگر استفاده از کتابخانه های ژنومی است. در این روش مجموعه ژنوم موجود با استفاده از آنزیمهای محدودگر قطعه قطعه شده و هر یک همسانه سازی میشوند. در واقع به این ترتیب کتابخانه هایی ایجاد میشوند که کتابهایشان همان قطعه های دی.ان.آی هضم شده هستند که درون پلاسمیدها وارد شده اند.
تهیه کتابخانه های ژنومی:
تهیه کتابخانه های ژنومی با استفاده از روشهای مختلفی صورت میگیرد. اگر چه این کتابخانه ها بسته به روش مورد استفاده دارای تفاوتهای اساسی با یکدیگر هستند ولی به هر حال اصول کلی تهیه کتابخانه های ژنومی تقریبا یکسان است. برای تهیه کتابخانه ژنومی از یک موجود زنده ابتدا باید دی.ان.آ آن را استخراج کرد. کیفیت دی.ان.آ دارای اهمیت خاصی در تهیه کتابخانه مناسب میباشد. دی.ان.آی خالص شده با آنزیم محدودگر خاصی برش داده میشود انتخاب نوع آنزیم نیز دارای اهمیت خاصی است زیرا علاوه بر اینکه دامنه اندازه قطعه های دی.ان.آی موجود در کتابخانه را تعیین میکند باید به صورت منحصر به فردی درون پلاسمید یا حامل این قطعه ها نیز وجود داشته باشد. به طور همزمان حامل مناسب برای همسانه سازی دی.ان.آی هضم شده با همان آنزیم برش داده میشود. پس از هضم جداگانه دی.ان.آی ژنومی و حامل آنها را در مجاورت هم قرار داده و با آنزیم لیگاز به هم دوخته میشوند. به این ترتیب در داخل هر یک از حامل ها یک قطعه دی.ان.آی هضم شده ژنوم مورد نظر وارد شده است. این پلاسمیدهای نوترکیب برای تکثیر و نگهداری به داخل باکتری منتقل میشوند. به این ترتیب کتابخانه ای از قطعه های دی.ان.آی ژنومی ایجاد میشود که در داخل یک پلاسمید در درون سلولهای باکتریایی قرار گرفته اند. از حامل های مختلف و متعددی میتوان برای همسانه سازی دی.ان.آ و تهیه کتابخانه های ژنومی استفاده کرد. مهمترین این حامل ها عبارتند از پلاسمید، لامبدا، کروموزوم های مصنوعی مخمر و کروموزوم های مصنوعی باکتری. اما برای تهیه کتابخانه ژنومی با سی.دی.ان.آ به منظور تهیه کاوشگر برای آر.اف.ال.پی معمولا از پلاسمید استفاده میشود. پلاسمید ساده ترین و یکی از کوچکترین نوع حامل است که میتواند قطعه هایی کوچکتر از 4 کیلو باز را در خود جای دهد.
تهیه کتابخانه های سی.دی.ان.آ
اصول تهیه کتابخانه های ژنومی و کتابخانه های سی.دی.ان.آ یکی است. تنها تفاوت موجود در این است که برای تهیه کتابخانه های سی.دی.ان.آ به جای استخراج دی.ان.آ و هضم آن با یک آنزیم محدودگر، آر.ان.آ از بافت مورد نظر و در زمان مورد نظر استخراج میشود و از روی آن سی.دی.ان.آ ساخته میشود. سپس سی.دی.ان.آی ساخته شده در درون پلاسمید مورد نظر همسانه سازی میشود بنابراین درحالیکه بدون توجه به بافت و زمان استخراج دی.ان.آ از یک موجود فقط یک کتابخانه ژنومی میتوان تهیه نمود. کتابخانه های سی.دی.ان.آی متعددی را میتوان از بافتها و در شرایط متفاوتی تهیه کرد.
نشاندار کردن کاوشگرها برای شناسایی قطعه های خاص
همانطور که ذکر شد آر.اف.ال.پی های مربوط به دی.ان.آی ژنوم های بزرگ بطور مستقیم قابل مشاهده نیستند. از این رو از قطعه های کوچکی از دی.ان.آی کروموزومی به عنوان کاوشگر برای آشکارسازی قطعه های خاصی از دی.ان.آ استفاده میشود پیش از این در مورد نحوه تهیه کاوشگرها مطالبی بیان شد اکنون توضیحاتی در مورد نحوه نشاندار کردن کاوشگرها ارائه میشود.
روشهای متفاوتی برای نشاندار کردن کاوشگرها وجود دارد که به حساسیت مورد نیاز برای آشکار سازی قطعه های دورگ گیری شده بستگی دارد. مواد پرتوزا مانند(35sوp 32وp35) اولین گروه موادی بودند که برای نشاندار کردن مورد استفاده قرار گرفتند. اما به دلیل اینکه کار با مواد پرتوزا شرایط ویژه ای دارد. برخی از پژوهشگران به استفاده از روشهای جایگزین مانند استفاده از بیوتین، دیگوکسی جنین و فلورسین روی آوردند.
روش های عمده تهیه کاوشگر های نشاندار عبارت اند از:
1. روش ترجمه بریدگی
2. استفاده از آغازگرهای تصادفی
3. نشاندار کردن با استفاده از روش واکنش زنجیره ای پلیمراز
4. روش نشاندار کردن انتهایی
5. نشاندار کردن مستقیم
1. روش ترجمه بریدگی:
در این روش ابتدا دی.ان.آ به کمک آنزیمهای دی.ان.آز 1 شکاف داده میشود. این آنزیم به طور تصادفی شکافهای تک رشته ای را در دی.ان.آ ایجاد میکند. سپس دی.ان.آی شکافته شده با آنزیم دی.ان.آ پلیمراز 1 تیمار میشود. این آنزیم که به طور طبیعی در ترمیم خسارت دی.ان.آ شرکت دارد از قدرت حذف نوکلئوتیدها و سپس پلی مریزاسیون آنها برخوردار است. بنابراین به کمک این آنزیم مولکول دی.ان.آ را از شکاف همانندسازی میشود. در مخزن نوکلئوتیدی مورد استفاده این آنزیم، یک یا دو نوع نوکلئوتید نشاندار قرار داده میشود و بدین ترتیب در درون مولکول دی.ان.آی ساخته شده قرار میگیرد. نوکلئوتیدها را میتوان با استفاده از رادیوایزوتوپ ها یا از طریق بیوتین، دیگوکسی جنین و فلوروسین نشاندار کرد.
2. استفاده از آغازگرهای تصادفی
روش اتصال تصادفی آغازگر نیز مانند روش ترجمه بریدگی، کاوشگرهای دی.ان.آی تک رشته ای را ایجاد میکند. ابتدا دی.ان.آ واسرشته شده و سپس گروهی از هگزامرها (به عنوان آغازگرها) به دی.ان.آ کاوشگر متصل میشود. هگزامرها دارای همه انواع ممکن از ترتیب قرار گرفتن چهار نوع نوکلئوتید هستند. دی.ان.آ پلیمراز امکان ایجاد رشته های جدید از آغازگرها را فراهم میسازد و بدین طریق نوکلئوتیدهای نشاندار در رشته جدید ساخته شده قرار میگیرند. از آنجا که ردیف آغازگرها تصادفی است بنابراین امکان داشتن هر نوع ردیف در کاوشگرهای نشاندار وجود خواهد داشت. اگر به جای دی.ان.آ پلیمراز از آنزیم رونوشت بردار معکوس استفاده شود میتوان کاوشگر مکمل مولکول ام.آر.ان.آ را نیز ایجاد کرد. کاوشگر حاصل دو رشته ای خواهد بود که میتوان آن را با استفاده از سود سوزآور یا حرارت تک رشته ای کرد.
3. نشاندار کردن با استفاده از روش واکنش زنجیره ای پلی مراز
روش نشاندار کردن با استفاده از پی.سی.آر کاوشگرهای نشاندار دو رشته ای را به وجود می آورد که میتوان با استفاده از حرارت آنها را تک رشته ای نمود. از مزیت های این روش این است که نسبت به روشهای دیگر به دی.ان.آی کمتری نیاز دارد و از طرف دیگر محصولات ایجاد شده همگی دارای طول یکسان هستند و مقدار کاوشگر نشاندار به دست آمده نیز بیشتر از سایر روشها خواهد بود. در این روش میتوان یکی از نوکلئوتیدهای موجود در ترکیب واکنش زنجیره ای پلیمراز را از نوع پرتوزای آن انتخاب و در محلول واکنش قرار داد. به این ترتیب همه رشته های تکثیر شده نشاندار خواهند بود.
4. روش نشاندار کردن انتهایی
به دلیل طبیعت موازی بودن دو رشته دی.ان.آ در یک انتهای مولکول یک رشته دارای انتهای 5’-po4 و رشته دیگر دارای 3’-oh است. به کمک آنزیمها میتوان این انتهاها را نشاندار کرد.
الف. نشاندار کردن انتهای 5’
شامل استفاده از آنزیم پلی نوکلئوتید کیناز t4 است. تا به کمک این آنزیم انتهای غیر ایزوتوپی po4 با ایزوتوپ p32o4 نشاندار گردد. برای این منظور ابتدا در گام اول به کمک آنزیمهای الکالین فسفاتاز 5’-po4 غیر ایزوتوپی حذف میگردد و سپس در گام دوم به کمک آنزیم پلی نوکلئوتید کیناز ایزوتوپ p32o4 جایگزین میشود. این مورد برای کاوشگرهایی با طول زیاد کارایی کمی دارد.
ب. نشاندار کردن انتهای 3’
نشاندار کردن انتهای 3’ به دو طریق امکان پذیر است: در روش اول به کمک آنزیم ترمینال داکسی نوکلئوتیدیل ترنسفراز میتوان چندین نوکلئوتید را به انتهای 3’-oh اضافه کرد. در روش دوم کاوشگر دی.ان.آ را میتوان با یک آنزیم برشی مناسب برش داده و سپس به کمک قطعه کلنو آنزیم دی.ان.آ پلیمراز 1 میتوان انتهای 3’-oh برش داده شده را با نوکلئوتیدهای نشاندار پر و انتهای صاف ایجاد کرد.
5. نشاندار کردن مستقیم
این روش شامل استفاده از عامل اتصال دهنده گلوتارآلدئید برای اتصال مستقیم پراکسیداز و یا آلکالین فسفاتاز به دی.ان.آ است. این روش نسبت به روشهای قبلی سریعتر است.
علاوه بر کاوشگرهای دی.ان.آ کاوشگرهای آر.ان.آ نیز در دسترس هستند و از مزایای زیر برخوردار اند:
· کاوشگرهای آر.ان.آ تک رشته ای هستند بنابراین قبل از استفاده نیازی به واسرشته سازی ندارند.
· از آنجا که کاوشگرهای آر.ان.آ قابل اتصال به یکدیگر نیستند از این رو تمامی مولکولهای کاوشگرهای آر.ان.آ برای شناسایی ردیف مورد جست و جو در دسترس خواهند بود.
· کاوشگرهای آر.ان.آ از پایداری حرارتی بالایی برخوردارند.
· مانند کاوشگرهای دی.ان.آی ایجاد شده از روش نشاندار کردن پی.سی.آر از طول یکسان برخوردار اند و بطور پیوسته نشاندار شده اند.