تکنیک های سلولی و مولکولی مورد استفاده در مراکز تحقیقاتی

[هیوا]

با سلام به تمام دوستان و علاقه مندان به تحقیقات در زمینه سلولی و مولکولی.
دوستان در این تاپیک قراره که تکنیک های سلولی و مولکولی که به صورت روتین در آزمایشگاه های تحقیقاتی استفاده میشه به ترتیب معرفی و توضیح داده بشه.علاوه بر این هریک از دوستان اگر برای انجام تحقیقاتش به تکنیک خاصی نیاز داره یا اینکه در مورد تکنیک خاصی سوال داره میتونه همینجا مطرح کنه.انشا الله پاسخ داده خواهد شد.

[هیوا]

تاريخچه RFLP ‌
RFLP‌‌‌‌ اولين‌ بار در سال‌ 1974 به‌ عنوان‌ يك‌ ماركر ژنتيكي‌ توسطGrodzicker ‌ و همكاران براي‌ تعيين‌ جهش‌ در ويروس‌ به‌ كار گرفته‌ شد. استفاده‌ ازRFLPبه‌ عنوان‌ ماركر بيماري‌ ژنتيكي‌اولين‌ بار توسطKon ‌و Dozy (1974) براي‌ آناليز بيماري‌ كم‌ خوني‌ داسي‌ شكل‌ به‌ كار گرفته‌ شد.Botstein و همكاران‌ 1980تئوري‌ پايه‌ اين‌ روش‌ را براي‌ نقشه‌يابي‌ ژنهاي‌ مرتبط‌ با بيماري‌ درانسان‌ مطرح‌ كردند. Southern روش‌ انتقال‌ الگويDNA ‌ و پروب‌ (كاوشگر) از ژل‌ به‌غشاء نيتروسلولزي‌ درRFLPرا ابداع‌ كرد.
Backman‌‌‌‌ (1986) براي‌ اولين‌ بار استفاده‌ از اين‌ نشانگر را مطرح‌ نمود. كاربردهاي‌ مهم همچون‌ نقشه‌يابي‌ و دستكاري‌ مكانهاي‌ ژنهاي‌ كنترل‌ كننده‌ صفات‌ كمي‌ با استفاده‌ ازRFLPدر سال‌1983 توسطBackman‌ وSoller بيان‌ گرديد. با گسترش‌ كاربرد اين‌ نشانگر قدرتمند چند ژن‌ يا ژنوم‌آناليز شدند تعدادي‌ از گونه‌هاي‌ دام‌ چون‌ گاو، گوسفند، بز، اسب، خوك‌ و جوجه‌ نيز با استفاده‌ از اين‌نشانگر آناليز شدند

كليات‌ تكنيك‌
‌‌‌‌مشخص‌ شده‌ است‌ كه‌ ژنوم‌ موجودات‌ به‌ طور طبيعي‌ داراي‌ تفاوتهائي‌ در رديف‌ بازهاي‌ خطي مي‌باشند اين‌ تغييرات‌ طبيعي‌ كه‌ سبب‌ گوناگوني‌ در افراد يك‌ جمعيت‌ مي‌شود چند شكلي‌ ژنتيكي‌نام‌ دارد. اگر اين‌ چند شكلي‌ در رديف‌ بازهايDNA ‌ در جايگاه‌ شناسائي‌ آنزيم‌ محدودكننده‌ ايجادشده‌ باشند به‌ راحتي‌ قابل‌ رديابي‌ استRFLP . وجود الگوهاي‌ غيريكسان‌ است‌ كه‌ بر اثر هضم‌آنزيمي‌ يك‌ ناحيهِ خاص‌ ازDNA بوسيلهِ آنزيمهاي‌ محدود كننده‌ مشخص‌ مي‌شود. اين‌ الگوهاي‌غيريكسان‌ به‌ علت‌ تفاوتDNA ‌ بسته‌ به‌ حضور يا عدم‌ حضور جايگاه‌ آنزيمهاي‌ محدود كننده‌بوجود مي‌آيد اين‌ الگوها را به‌ دو شكل‌ مي‌توان‌ مشخص‌ كرد .
- هضم‌ آنزيمي‌ و سپس‌ الكتروفوز و استفاده‌ از لكه‌گذاري‌ ساترن
PCR فطعه‌ مورد نظر و هضم‌ آنزيميRFLP‌‌‌‌ مستقيما روي‌ تظاهر ژن‌ از طريق‌ تغيير در شكل‌گيريmRNA ‌و ميزان‌ و تعداد نسخه‌برداري‌ تاثير مي‌گذارد.

www.iranbiology.ir (http://www.iranbiology.ir)

[mrezakarimi]

از مطلب خوبی که شروع کردید ممنونم انشاالله ادامه داشته باشه
منم سعی می کنم در آینده ای نزدیک فعالیتم رو شروع کنم با عرض پوزش یکم سرم شلوغه

[هیوا]

از حضورتون در سایت و علی الخصوص در بخش زیست شناسی بسیار خوشحالم.خوش آمدید. منتظر فعالیت های بیشتر شما در سایت و علی الخصوص بخش زیست شناسی هستیم{happy}

[هیوا]

PCR یا polymerase chain reaction :


تعريف PCR
به طور كلي Polymerase Chain Reaction (PCR) به روش ازدياد مقادير جزيي DNA يا RNA (ازدياد RNA با روش RT-PCR امكان پذير است) تا حد مشاهدهء آنها توسط روش هاي ساده و رايج آزمايشگاهي اطلاق مي شود. قابليت PCR در ازدياد اسيدهاي نوكلئيك موجود در نمونه مورد آزمايش موجب شناسايي سريع و اختصاصي نوع سلول يا ميكروارگانيسم مورد نظر در نمونه مذكور مي گردد كه اين ويژگي علاوه بر بكارگيري PCR در تشخيص آزمايشگاهي بيماريها شناسايي انواع سلولها، آنرا به عنوان ابزاري مطمئن و حساس در زمينه پژوهش هاي علمي مطرح مي سازد.
از زمان معرفي PCR در سال 1985، بكارگيري آن در تحقيقات بيولوژيكي پايه و كاربردي موجب ايجاد تغييرات اساسي گرديده است. PCR يكي از جديدترين تكنولوژي هاي آزمايشگاهي است كه در تشخيص بيماريهاي عفوني، پزشكي قانوني و ناهنجاريهاي ژنتيكي مورد استفاده و توجه قرار گرفته است. در خصوص كارآيي اين روش در تشخيص به عنوان مثال مي توان تقليل مدت زمان تشخيص آزمايشگاهي اختصاصي باسيل سل در نمونه هاي كلينيكي را از 7-6 هفته به 7-6 ساعت حتي با وجود تعداد اندك باسيل در نمونهء آزمايشگاهي ذكر كرد. از نكات جالب توجه ديگر اينكه با استفاده از تكنيك حساس PCR ، DNA ميكروارگانيسم هايي نظير باسيل جذام و باسيل سل از نمونه هاي باستاني با قدمت بيش از 1000 سال شناسايي و جدا گرديده است كه نتايج حاصله گامي مهم در راه شناخت و مطالعه بيش از پيش تاريخچه علم پزشكي بوده ضمن آنكه اين موفقيت توانسته است راهگشاي ايجاد شاخه هاي ديگري از علوم نظير پالئوباكتريولوژي باشد.

هر چرخه PCR شامل سه مرحله مي باشد(شکل 1):
1-مرحله تقليب يا تغيير ماهيت
(Denaturation Step) :
در اين مرحله مولكولهاي دو رشته اي DNA بوسيله حرارت بالا (حدود 94 درجه سانتيگراد) از همديگر جدا گرديده و به مولكولهاي تك رشته اي تبديل مي شوند.
2-مرحله پيوند زني
(Annealing or Hybridization Step) :
در اين مرحله كاهش دماي واكنش صورت مي گيرد تا اينكه پرايمرها بتوانند به مولكولهاي DNA تك رشته اي پيوند زده شوند. درجه حرارت مورد استفاده براي اين مرحله مي تواند از 30 درجه سانتيگراد تا 72 درجه سانتيگراد متغير باشد.
3-مرحله توسعه (Extension Step) :
در اين مرحله آنزيم Taq پليمراز (DNA پليمراز) پرايمرها را در روي DNA تك رشته اي امتداد مي دهد تا DNA دو رشته اي جديد بسازد. درجه حرارت لازم براي اين مرحله 72 درجه سانتيگراد مي باشد.

http://njavan.com/forum/imagehosting/thum_50614a60f3724b5f0.gif (http://njavan.com/forum/vbimghost.php?do=displayimg&imgid=286)

شکل 1



از زمان اختراع PCR، دو پيشرفت تكنيكي عمده به طور قابل توجهي روند PCR را اصلاح كرده است. اولين پيشرفت، بكارگيري و ترويج پليمرازهاي مقاوم به حرارت همانند Taq پليمراز بوده است كه اين آنزيم توانايي مقاومت در برابر مرحله تغيير ماهيت يا تقليب يعني حدود 94 درجه سانتيگراد را دارد. اين بدان معني است كه در حال حاضر مي توان بدون افزودن آنزيم پليمراز تازه بعد از هر مرحله تغيير ماهيت (تقليب) به لوله هاي PCR، آزمايش PCR را انجام داد. دومين پيشرفت عمده، توسعهء تجارتي بلوك هاي حرارتي قابل برنامه ريزي مي باشد كه اين بلوك ها به ترمال سايكلرها (Thermal cycler) معروف هستند. استفاده از ترمال سايكلر در انجام PCR باعث حذف مرحلهء خسته كننده و وقت گير انتقال لوله‌هاي PCR از يك بن ماري به بن ماري ديگر مي شود ، زيرا اين دستگاه كه قبلاً بوسيله خود آزمايش كننده تنظيم و برنامه ريزي شده است به طور اتوماتيك حرارتهاي لازم را براي مراحل سه گانه PCR توليد مي نمايد ضمن اينكه تعداد چرخه هاي مورد نياز نيز براي انجام PCR و ازدياد DNA بطور اتوماتيك در اين دستگاه بوقوع مي پيوندد.
با دو پيشرفت فوق الذكر اكنون ما مي توانيم تمامي اجزاء PCR را كه عبارتند از بافر PCR، دو نوع پرايمر، چهار نوع داُكسي نوكلئوتيد تري فسفات dCTP , dTTP , dATP) و (dGTP، آنزيم Taq پليمراز و DNA الگو (كه با روش هاي مختلف قابل استخراج مي باشد)، با همديگر در لوله هاي پلي پروپيلن مخلوط كرده (شكل 2) و پس از افزودن يك قطره روغن معدني بر سطح مخلوط ها، بدون حضور شخص آزمايش كننده لوله هاي PCR را به مدت چند ساعت در ترمال سايكلر برنامه ريزي شده از قبل قرار داد تا PCR انجام شود. واكنش هاي تكميل شده بر روي ژل آگارز برده شده و سپس محصولات PCR يا به عبارت ديگر DNAهاي ازدياد يافته در روي ترانسيلوميناتور ماوراء بنفش 302 نانومتر قابل رويت مي شوند.

http://njavan.com/forum/imagehosting/50614a60f42732bfe.bmp (javascript:void(0))

شکل 2

[هیوا]

http://uc-njavan.ir/uploder/files/y88/4-5-6/Image002.jpg

تصویری از دستگاه PCR



انواع PCR :

بمنظور نتيجه گيري بهتر، غير از PCR معمولي روش هاي جديدي از PCR ارائه شده است كه به صورت اجمالي به برخي از آنها اشاره مي شود.



1- آر تي _ پي سي آر (RT-PCR)
(Reverse Transcriptase-PCR)
الگوي اوليه در RT-PCR، مولكول RNA تك زنجيره اي است. از آنجائيكه DNA پليمراز قادر به استفاده از RNA بعنوان الگو نمي باشد، مرحله ديگري به PCR اضافه شده است. طي اين مرحله، با استفاده از آنزيم رورس ترانس كريپتاز (Reverse Transcriptase) RT ، از الگوي RNA، مكمل آن DNA‌C (complementary DNA)
سنتز مي شود و بوسيله تكنيك PCR تكثير مي يابد. بمنظور تعيين گونه و حساسيت دارويي در ويروس شناسي و مايكوباكتريولوژي، از اين روش براي تكثير RNA ريبوزومي استفاده مي شود.



2- نستد – پي سي آر (Nested-PCR)
در اين روش بمنظور افزايش حساسيت PCR از دو جفت پرايمر استفاده مي شود. ابتدا با يك جفت پرايمر اول در طول 30-15 چرخه، قطعات مشخصي از DNA هدف تكثير مي يابند. سپس محصول PCR حاصل به لوله ديگري منتقل شده و بعنوان الگو استفاده مي شود و بوسيله جفت پرايمرهاي دوم مرحله دوم PCR انجام مي شود.



3 - مالتيپلكس – پي سي آر
(Multiplex-PCR)
در اين روش از چند جفت پرايمر اختصاصي براي هدف هاي مختلف استفاده مي شود. در ميكروب شناسي باليني، با استفاده از اين روش امكان شناسايي چندين عامل بيماري در يك نمونه بطور همزمان وجود دارد و مي توان عفونت هاي مخلوط را تشخيص داد.



آرمز – پي سي آر (ARMS-PCR)
(Amplification Refractory Mutation System-PCR)
روش آرمز _ پي سي آر (ARMS-PCR) براي تشخيص موتاسيون هاي نقطه اي بكار مي رود و از دو جفت پرايمر استفاده مي شود. در اين روش، واكنش در دو لوله جداگانه انجام مي شود كه يكي از آنها حاوي پرايمرهاي نوع موتاسيون يافته و ديگري حاوي پرايمرهاي نوع معمولي است. چنانچه تكثير در لوله حاوي پرايمر موتاسيون يافته انجام شود، در DNA هدف، موتاسيون اتفاق افتاده است و تكثير در لوله حاوي پرايمر معمولي، نشان دهنده آن است كه موتاسيوني اتفاق نيفتاده است. از اين متد مي توان در تشخيص موتاسيون هاي مولد مقاومت دارويي در باكتري‌ها استفاده كرد.

[hossien]

روش کار با دستگاه را میشه توضیح بدین منظورم اگر از محلول استفاده میشه کجا قرار می گیره و مکانیزم دستگاه چیه ؟

[هیوا]

محلول های مورد استفاده وقتی طبق توضیحات داده شده در بالا در یک میکرو تیوب(یک تیوب خیلی کوچک با طول تقریبا یک سانتی متر و قطر حدود 5 میلی متر) ریخته و با هم مخلوط شد تیوب ها درون دستگاه pcr قرار داده می شوند.وقتی درب دستگاه pcr مطابق شکل زیر باز می شود

http://www.ziddu.com/view1.php?file=dGVtcDIvUC8yMDA5LTctMjEvMTI0ODE3Nzc 1MV9hdmF0b3IuZ2lm&tid=1248177764
در حفره ای که مشاهده می شود 96 حفره کوچک (مصابق شکل زیر)وجو دارد که می توان 96 میکروتیوب را همزمان در دستگاه قرار داد

http://www.ziddu.com/view1.php?file=dGVtcDIvUC8yMDA5LTctMjEvMTI0ODE3Nzk 4MF93LmJtcA==&tid=1248177998
سپس دمای مراحل مختلف pcr طبق آزمایش مورد نظر تنظیم میشود و سپس start جهت شروع عملیات زده می شود.
برای تنظیم دما چیزی شبیه صفحه کامپیوتر در جلو دستگاه pcr قرار دارد که در واقع یم مانیتور یا صفحه نمایش است و اطلاعات وارد شده توسط فرد آزمایشگر روی آن نمایش داده می شود.
در زیر تصویری از صفحه نمایش یک دستگاه pcr نشان داده شده است.


http://www.ziddu.com/view1.php?file=dGVtcDIvUC8yMDA5LTctMjEvMTI0ODE3ODQ 2OF9JbWFnZTAwMy5qcGc=&tid=1248178481

[hossien]

می دونید حرارتی که برای باز کردن dna ایجاد می کنه از چه منبعی هست؟

[hossien]

منظورم

[hossien]

منظرم از این سوالات اینه که آیا ما می تونیم این دستگاه را تولید کنیم یا ما تکنولوژی این نوع از دستگاه ها را نداریم.

[هیوا]

می دونید حرارتی که برای باز کردن dna ایجاد می کنه از چه منبعی هست؟
نه متاسفانه منبع تولید حرارت رو نمی دونم.ولی باید حرارت تا حدود 105 درجه بالا بره و ابتدا درب دستگاه رو گرم کنه.دستگاه طوری تعبیه شده که وقتی درب اون بسته میشه درب کاملا روی درب میکروتیوبها قرار میگیره و با محکم کردن درب دستگاه از تبخیر محلولها در معرض گرمای بالا جلوگیری میشه.این درب باید تا حدود105 درجه گرم بشه.

[Amir]

منبع تولید حرارت تو دستگاهای با این ابعاد میتونه به دو شکل باشه البته فک میکنم چیزی که مهمه کنترل حرارت هستش .. تولید حرارت با استفاده از امواج ماکرو که برای موادی که حاوی اب هستند میتونه باشه که هم سرعت و هم فارگیری و ÷خش یکسانتری رو داره .. البته از معیبش تحت کنترل نیودن حرارت هستدر مقایسه با نوع المنتی که با استفاده از مقاومتهای حرارتی حرارت ایجاد و توسط سنسورهای دما کنترل میشه این دستگاه ایجاد حرارت و یا سرما به zone select شهرت دارند و تو ازماایشگاه هم برای تولید سرمایی کنترل شده و هم گرمای کنترل شده کاربرد دارند .. در مورد طراحی و ساخت ساخت محیط قابل کنترل سرد پیچیده تره ..

[هیوا]

blotting ( بلاتینگ)

به طور کلی در ژنتیک مولکولی (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%DA%98%D9%86%D8%AA%DB%8C%DA%A9_%D9 %85%D9%88%D9%84%DA%A9%D9%88%D9%84%DB%8C&action=edit) به عمل انتقال مولکولهای تفکیک شده در الکتروفورز (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D8%A7%D9%84%DA%A9%D8%AA%D8%B1%D9%88%D9%81%D9%88%D 8%B1%D8%B2) از ژل به روی یک غشاء ویژه، بلاتینگ یا بلات کردن گفته می‌شود. معنای واژهٔ انگلیسی بلاتینگ، لکه‌گذاری است.
برای انجام اعمالی مانند هیبریداسیون (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%D9%87%DB%8C%D8%A8%D8%B1%DB%8C%D8% AF%D8%A7%D8%B3%DB%8C%D9%88%D9%86&action=edit) اسیدهای نوکلئیک (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%D8%A7%D8%B3%DB%8C%D8%AF%D9%87%D8% A7%DB%8C_%D9%86%D9%88%DA%A9%D9%84%D8%A6%DB%8C%DA%A 9&action=edit) و شناسایی پروتئینها (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%BE%D8%B1%D9%88%D8%AA%D8%A6%DB%8C%D9%86) با پادتن‌ها (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%BE%D8%A7%D8%AF%D8%AA%D9%86)، ژل محیط مناسبی نیست. علت اصلی این مسئله نفوذپذیری کم ژل و خروج شناساگرها (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%D8%B4%D9%86%D8%A7%D8%B3%D8%A7%DA% AF%D8%B1&action=edit) (Probe) از ژل (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%DA%98%D9%84&action=edit) می‌باشد. از اینرو در صورت انجام عمل آشکارسازی به کندی و با مشکل صورت می‌گیرد. اما غشاء، محیط مناسبی برای اعمال فوق فراهم می‌کند.
سادرن بلاتینگ:

برای انتقال مولکولهای DNA از ژل به غشاء از روشی استفاده می‌شود که سادرن بلاتینگ نام دارد (در فارسی اشتباهاً ساترن بلاتینگ هم نوشته شده). این روش ابتدا توسط ادوین سادرن (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%D8%A7%D8%AF%D9%88%DB%8C%D9%86_%D8 %B3%D8%A7%D8%AF%D8%B1%D9%86&action=edit) از دانشگاه آکسفورد (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D8%AF%D8%A7%D9%86%D8%B4%DA%AF%D8%A7%D9%87_%D8%A2% DA%A9%D8%B3%D9%81%D9%88%D8%B1%D8%AF) ابداع شد. در این روش از خاصیت موئینگی (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%D8%AE%D8%A7%D8%B5%DB%8C%D8%AA_%D9 %85%D9%88%D8%A6%DB%8C%D9%86%DA%AF%DB%8C&action=edit)، برای انتقال مولکولهای DNA استفاده می‌شود. اصول این روش به این صورت است که پس از تفکیک مولکولها بر روی ژل، آن را در محلول هیدرو کسید سدیم قرار داده تا مولکولهای DNA دو رشته‌ای واسرشت (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%D9%88%D8%A7%D8%B3%D8%B1%D8%B4%D8% AA&action=edit) شوند. درصورتیکه که ژل حاوی مواد واسرشت کننده باشد نیازی به این مرحله نیست. سپس ژل برروی سکویی که دریک ظرف حاوی بافر قرار دارد، منتقل نموده و بر روی آن غشاء نیتروسلولز (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%D9%86%DB%8C%D8%AA%D8%B1%D9%88%D8% B3%D9%84%D9%88%D9%84%D8%B2&action=edit) قرار می‌دهند. بر روی غشاء مزبور چندین لایه کاغذ نمگیر قرار داده می‌شود. این لایه‌ها باعث برقراری جریان بافر به سمت بالا می‌شود از ژل به غشا می‌شوند. همراه با جریان بافر (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D8%A8%D8%A7%D9%81%D8%B1)، مولکولهای DNA از ژل خارج شده و بر روی غشاء نیتروسلولزی یا نایلونی قرار می‌گیرند. غشاء هائی که برای این منظور به کار گرفته می‌شوند کاملاً اختصاصی بوده ودارای بار الکتریکی مثبت می‌باشند، در نتیجه مولکولهای اسید نوکلئیک به طور محکم به انها متصل می‌شوند.

نوردرن بلاتینگ:

از آنجا که RNA به سختی به کاغذهای نیتروسلولزی متصل می‌شود، از روش سادرن نمی‌توان برای مولکولهای RNA استتفاده کرد. برای انتقال مولکولهای RNA از روشی بنام نوردرن بلاتینگ استفاده می‌شود. اساس این روش مشابه روش سادرن بلاتینگ است. با این تفاوت که در آن از کاغذهای فعال شده یا کاغذهای DBM، استفاده می‌شود. این کاغذها را می‌توان به راحتی با تیمارهای شیمیایی خاصی از کاغذ صافی (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%DA%A9%D8%A7%D8%BA%D8%B0_%D8%B5%D8 %A7%D9%81%DB%8C&action=edit) تهیه کرد. در این روش، به علت تک رشته‌ای بودن RNA و تفکیک آن بر روی ژل واسرشت کننده نیازی به مرحله مجاورت با هیدرکسید سدیم نمی‌باشد. در ضمن به علت حساس بودن مولکولهای RNA دقت بیشتری در انجام مراحل لازم می‌باشد.

وسترن بلاتینگ:

برای انتقال پروتئینهای تفکیک شده بر روی ژل به غشاء از تکنیک وسترن بلاتینگ استفاده می‌شود. این روش نیز مشابه روش سادرن بلاتینگ می‌باشد با این تفاوت که جریان بافر (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D8%A8%D8%A7%D9%81%D8%B1) به صورت افقی است. اخیرا روشهای بلاتینگ جدیدی از ترکیب روشهای بالا ابداع شده‌اند. از جمله این روشها روش بلاتینگ جنوب غربی و بلاتینگ شمال غربی را می‌توان نام برد. روش اول برای انتقال پروتئینهایی که به DNA متصل می‌شوند استفاده می‌شود و روش دوم برای پروتئینهایی که به RNA متصل می‌شوند، به کار گرفته می‌شود.

[سمیرا بیات]

سلام-میشه در موردpcr-rflpکمکم کنید احتیاج به مقله دارم

[هیوا]

با سلام .دوست عزیز من در اینجا کلیات در مورد سوالی که پرسیدید میگذارم.اگر باز سوالی داشتید بپرسید.موفق باشید.

تاريخچه RFLP ‌
RFLP‌‌‌‌ اولين‌ بار در سال‌ 1974 به‌ عنوان‌ يك‌ ماركر ژنتيكي‌ توسطGrodzicker ‌ و همكاران براي‌ تعيين‌ جهش‌ در ويروس‌ به‌ كار گرفته‌ شد. استفاده‌ ازRFLPبه‌ عنوان‌ ماركر بيماري‌ ژنتيكي‌اولين‌ بار توسطKon ‌و Dozy (1974) براي‌ آناليز بيماري‌ كم‌ خوني‌ داسي‌ شكل‌ به‌ كار گرفته‌ شد.Botstein و همكاران‌ 1980تئوري‌ پايه‌ اين‌ روش‌ را براي‌ نقشه‌يابي‌ ژنهاي‌ مرتبط‌ با بيماري‌ درانسان‌ مطرح‌ كردند. Southern روش‌ انتقال‌ الگويDNA ‌ و پروب‌ (كاوشگر) از ژل‌ به‌غشاء نيتروسلولزي‌ درRFLPرا ابداع‌ كرد.
Backman‌‌‌‌ (1986) براي‌ اولين‌ بار استفاده‌ از اين‌ نشانگر را مطرح‌ نمود. كاربردهاي‌ مهم همچون‌ نقشه‌يابي‌ و دستكاري‌ مكانهاي‌ ژنهاي‌ كنترل‌ كننده‌ صفات‌ كمي‌ با استفاده‌ ازRFLPدر سال‌1983 توسطBackman‌ وSoller بيان‌ گرديد. با گسترش‌ كاربرد اين‌ نشانگر قدرتمند چند ژن‌ يا ژنوم‌آناليز شدند تعدادي‌ از گونه‌هاي‌ دام‌ چون‌ گاو، گوسفند، بز، اسب، خوك‌ و جوجه‌ نيز با استفاده‌ از اين‌نشانگر آناليز شدند


كليات‌ تكنيك‌
‌‌‌‌مشخص‌ شده‌ است‌ كه‌ ژنوم‌ موجودات‌ به‌ طور طبيعي‌ داراي‌ تفاوتهائي‌ در رديف‌ بازهاي‌ خطي مي‌باشند اين‌ تغييرات‌ طبيعي‌ كه‌ سبب‌ گوناگوني‌ در افراد يك‌ جمعيت‌ مي‌شود چند شكلي‌ ژنتيكي‌نام‌ دارد. اگر اين‌ چند شكلي‌ در رديف‌ بازهايDNA ‌ در جايگاه‌ شناسائي‌ آنزيم‌ محدودكننده‌ ايجادشده‌ باشند به‌ راحتي‌ قابل‌ رديابي‌ استRFLP . وجود الگوهاي‌ غيريكسان‌ است‌ كه‌ بر اثر هضم‌آنزيمي‌ يك‌ ناحيهِ خاص‌ ازDNA بوسيلهِ آنزيمهاي‌ محدود كننده‌ مشخص‌ مي‌شود. اين‌ الگوهاي‌غيريكسان‌ به‌ علت‌ تفاوتDNA ‌ بسته‌ به‌ حضور يا عدم‌ حضور جايگاه‌ آنزيمهاي‌ محدود كننده‌بوجود مي‌آيد اين‌ الگوها را به‌ دو شكل‌ مي‌توان‌ مشخص‌ كرد .
- هضم‌ آنزيمي‌ و سپس‌ الكتروفوز و استفاده‌ از لكه‌گذاري‌ ساترن
PCR فطعه‌ مورد نظر و هضم‌ آنزيميRFLP‌‌‌‌ مستقيما روي‌ تظاهر ژن‌ از طريق‌ تغيير در شكل‌گيريmRNA ‌و ميزان‌ و تعداد نسخه‌برداري‌ تاثير مي‌گذارد.


‌‌‌‌در روشRFLP ‌ ابتدا نمونه‌اي‌ ازDNAرا با يكنوع‌ آنزيم‌ برشي، هضم‌ مي‌كنند كه‌ در نتيجه تعداد زيادي‌ قطعه‌ با طول‌ متفاوت‌ بدست‌ مي‌آيد، سپس‌ اين‌ قطعات‌ با استفاده‌ از ژل‌ آگارز ازهمديگر جدا مي‌شوند شناسائي‌ وتشخيص‌ يك‌ قطعه‌خاص‌ با استفاده‌ از كاوشگرها امكانپذير است‌كه‌ اين‌ عمل‌ با استفاده‌ از تكنيك‌ ديگري‌ تحت‌ عنوان‌ لكه‌گذاري‌ ساترن صورت‌ مي‌گيرد

لكه‌گذاريSouthern‌‌ ‌
‌‌‌‌براي‌ انجام‌ عمل‌ هيبرايداسيون‌ لازم‌ است‌ كه‌ علاوه‌ بر قطعه‌ كاوشگر، قطعاتDNA ‌هضم شده‌ نيز تك‌ رشته‌اي‌ شوند لذا ابتداDNA روي‌ ژل‌ آگارز كه‌ حاوي‌ قطعات‌ هضم‌ شده‌ است‌ درمحلولهاي‌ قليائي‌ مثل‌ اوره‌ يا فرمالدئيد يا هيدروكسيدسديم‌ تك‌رشته‌ مي‌نمايند. سپس‌ صفحه‌اي‌ ازغشاء نيترو سلولزي‌ را روي‌ قسمت‌ فوقاني‌ ژل‌ قرار داده‌ و روي‌ آن‌ غشاء مقداري‌ كاغذ جاذبه‌ الرطوبه‌مي‌گذارند محلول‌ بافر تانك‌ الكتروفوزر بوسيله‌ فشار اسمزي‌ كاغذ فوقاني‌ بالا كشيده‌ مي‌شود و حين‌عبور از ژل‌ به‌ غشاء نيترو سلولزي‌ كه‌ داراي‌ بار مثبت‌ است‌ منتقل‌ مي‌گردد. با تسهيل‌ عمل‌هيبريداسيون‌ بين‌ كاوشكر و قطعاتDNA ‌ هضم‌ شده‌ در معرض‌ پروب‌ نشاندار راديواكتيو در نقاطي‌كه‌ همولوژي‌ وجود دارد هيبريد مي‌گردد. قطعاتي‌ كه‌ هيبريداسيون‌ در آنها صورت‌ نگرفته‌ است‌ ازمحيط‌ شسته‌ مي‌شوند و سپس‌ از غشاي‌ نيترو سلولزي‌ در مجاورت‌ فيلم‌ عكاسي‌ اتوراديوگرافي‌بعمل‌ مي‌آيد پس‌ از ظهور و ثبوت‌ فيلم‌ قطعات‌ ويژه‌اي‌ ازDNA كه‌ با پروب‌ هيبريد هستند به‌صورت‌ يك‌ باند مرئي‌ ديده‌ مي‌شود شكل‌ زير مراحل‌ انجام‌ لكه‌گذاريSouthern ‌ را نشان‌ مي‌دهد.مزايايRFLP ‌ عبارت‌ است‌ از موارد زير مي‌باشد:
- تحت‌ تاءثير محيط‌ نيست‌ و صددرصد ژنتيكي‌ است‌
- همبارز است‌
- تكرار پذيري‌ آن‌ بالاست‌

PCR-RFLP) PBR)
‌‌‌‌در روش‌ دومRFLP ‌، ابتدا قطعه‌ حاوي‌ جايگاه‌ چند شكلي‌ را با واكنش‌ زنجيرهِ پلي‌مراز واستفاده‌ از دو پرايمر مخصوص‌ كه‌ به‌ همين‌ منظور طراحي‌ شده‌ تكثير مي‌نمايند و پس‌ از هضم‌آنزيمي، الكتروفوز مي‌كنند. درPBR جهشهائي‌ از نوع‌ نقطه‌اي‌ و حذف‌ و اضافه‌ كه‌ باعث‌ تغيير درسطح‌ قطعه‌ آنزيمي‌ مي‌گردند قابل‌ تشخيص‌ است‌

‌‌فرق‌ لكه‌گذاري‌ ساترن وPBR
‌‌‌‌در RFLPساترن تنوعDNA‌در داخل‌ يك‌ منطقهKb ‌30 محصور توسط‌ پروب‌ تعيين مي‌گردد در حاليكه‌ درPBR تنوع‌ در داخل‌ منطقه‌اي‌ كه‌ از دو طرف‌ به‌ پرايمر ختم‌ شده‌ تعيين‌مي‌شود اين‌ ناحيه‌ معمولاKb2-0.5است. علاوه‌ بر اين‌ درPBRمزايائي‌ چون‌ سادگي، سرعت‌زياد، عدم‌ نياز به‌ مواد راديواكتيو و تكرارپذيري‌ بالا مطرح‌ مي‌باشد
‌‌‌‌ميزان‌ پلي‌مورفيسم‌ و تعداد آللها درPBR كمترازRFLPساترن مي‌باشد عباسي‌ (1376)نشانگرPBRبراي‌ تشخيص‌ پلي‌مورفيسم‌ در ژن‌ هورمون‌ رشد گاوهاي‌ هلشتاين‌ استفاده‌كرد Aggrey‌‌‌‌و همكاران‌ 1999 از ماركرPBR براي‌ تشخيص‌ پلي‌ مورفيسم‌ در ناحيهِ مجاور ژن‌ گيرنده‌ هورمون‌ رشد در گاوهاي‌ هلشتاين‌ كانادا استفاده‌ نمودند و الگوهاي‌ باندي‌ مختلفي‌ را درروي‌ ژل‌ مشخص‌ نمودند

[هیوا]

الكتروفوز محصولات PCR یا هر نمونه از نوکلئیک اسید:
ابتدا 1 گرم پودر آگارز را برای تهیه ژل 1درصد در 100 میلی لیتر از بافر tae ریخته و حرارت داده تا شفاف شود.پس از سرد شدن ژل تا دمای 55 درجه 5 میکرولیتر از اتیدیوم بروماید
005/0به آن اضافه كرده و در ظرف مخصوص حاوی شانه ریخته می شود.بعد از بسته شدن ژل، هر 5 میكرولیتر محصول ‍pcr یا نمونه نوکلئیک اسیدی با یک میكرولیتر لودینگ دای مخلوط نموده سپس در چاهكهای ژل قرار داده می شوند . با ولتاژ بالا حدود 100 ولت شروع تا اینكه نمونه ها از چاهك خارج شود سپس ولتاژ را به حدود 70 ولت رسانیده و سپس از یكساعت الكتروفورز نمونه ها با استفاده از دستگاه نور ماورا بنفش مورد بررسی قرار می گیرند.

[آسمانی]

باتشکر از شما .اگه ممکنه در مورد اینکه چطوری میشه از این روش برای تعیین بیان ژن در مر حله خاصی از نمو گیاه متلأ "گلدهی" استفاده کرد توضیح بدین .

[هیوا]

باتشکر از شما .اگه ممکنه در مورد اینکه چطوری میشه از این روش برای تعیین بیان ژن در مر حله خاصی از نمو گیاه متلأ "گلدهی" استفاده کرد توضیح بدین .
برای این منظور شما باید اول RNA را از نمونه همون مرحله از نمو گیاه را استخراج کنید بعد از ساخت cDNA ، بر اساس ژن مورد نظرتون و با استفاده از پرایمر اختصاصی که برای اون ژن طراحی کردید PCR می گذارید که اگر باند داد یعنی اون ژن بیان شده.
اما یک روش جدیدتر ه برای بررسی بیان ژن های مختلف وجود داره تکنیک Microarray هست.با این تکنیک می تونید بیان هزاران ژن رو به طور همزمان بررسی کنید.در این لینک مقاله ای هست که خودم در مورد microarray نوشتم میتونید مطالعه بفرمایید.http://www.njavan.com/forum/showthread.php?t=20481

[lvlohamadi]

برای این منظور شما باید اول RNA را از نمونه همون مرحله از نمو گیاه را استخراج کنید بعد از ساخت cDNA ، بر اساس ژن مورد نظرتون و با استفاده از پرایمر اختصاصی که برای اون ژن طراحی کردید PCR می گذارید که اگر باند داد یعنی اون ژن بیان شده.
اما یک روش جدیدتر ه برای بررسی بیان ژن های مختلف وجود داره تکنیک Microarray هست.با این تکنیک می تونید بیان هزاران ژن رو به طور همزمان بررسی کنید.در این لینک مقاله ای هست که خودم در مورد microarray نوشتم میتونید مطالعه بفرمایید.http://www.njavan.com/forum/showthread.php?t=20481


سلام
سمینار پایان ترم من درباره ی کاربرد microarray در شناسایی میکرواورگانیسم هاست ولی من هیچ گونه اطلاعاتی نسبت به این موضوع ندارم.
میشه از شما خواهش کنم منابعی رو برای مطالعه معرفی کنید یا توضیحاتی در این باره بدید؟ ممنون میشم.

[اسراء حمیدی]

تکنیک های خاصی گفته نشده و خیلی عمومی هستن..
من می تونم تکنیک های بیشتری در اختیارتون بذارم.:
کلونینگ
الکتروفورز
استخراج
کلا تولید پروتئین های نوترکیب
و...

[اسراء حمیدی]

در مورد هر کدوم اطلاعاتی خاستین برام ای میل بذارین:
asra.hamidi@gmail.com

[lnb]

با عرض سلام و خسته نباشید
لطفاً در صورت امکان تکنیک microarray را توضیح دهید
با تشکر

[zahra farahani]

سلام بچه ها هیچ کس مقاله یا کتاب ترجمه شده ای راجع به rt pcr می تونه به من معرفی کنه ؟

[taherbahrami]

سلام ، از کاری که شروع کردید ممنونم. سؤالی داشتم اینکه ؛ می خواستم اگر مطلبی در رابطه با روش های انجام پی سی آر در آزمایشگاه های تشخیص طبی برای شناسایی میکروب ها دارید برام بفرستید . باتشکر

[sara eng]

سلام خیلی ممنون از بحثی که در این بخش گذاشتین . خیلی جالبه[shaad]