هیوا
9th July 2009, 01:32 PM
شناسايى هويت يك مسئله مهم در پزشكى قانونى است كه در موارد تجاوزها، جنايات، تعيين هويت اجساد و بسيارى موارد ديگر ضرورت دارد.
روشهای تعیین هویت
روش هاى مختلفى در گذشته براى اين امر معمول بوده است، از جمله اثر انگشت، خصوصيات ظاهرى و بدنى مثل رنگ مو، جاى زخم، مشخصات دندان ها، يا اندازه هاى استخوان ها و... با كشف DNA راه جديدى براى تعيين هويت، حتى در مواردى كه مشخصات جسمى مثلاً در اجساد متلاشى شده قابل تعيين نيست، گشوده شد. در چند دهه اخير روش هاى شناسايى DNA تكميل شده و شناسايى سريع تر هويت را امكان پذير كرده است. به خصوص واقعه ۱۱ سپتامبر با قربانيان فراوانى كه به بار آورد و لزوم تعيين هويت آنها، باعث به وجود آمدن پيشرفت هاى تكنيكى در شيوه هاى شناسايى به وسيله DNA شد.
اثر انگشت ژنتيكى
آزمون شناسايى هويت از طريق DNA يا به اصطلاح اثر انگشت ژنتيكى در سال ۱۹۸۵به وسيله سرآلك جفريز از دانشگاه لاسيستر انگليس ابداع شد. انسان ها در بخش بزرگى از توالى هاى نوكلئوتيدهاى تشكيل دهنده DNA خود مشابهت دارند، اما بخش هايى از DNA وجود دارد كه از توالى هاى تكرارى بسيار متغير بين افراد مختلف تشكيل شده اند. اين بخش ها را اصطلاحاً بخش هاى ريزاقمارى (microsatellite) يا تكرارهاى متوالى كوتاهSTR (Shotr tandem repeats) مى نامند. او انسان غيرخويشاوند در يك جايگاه (locus) معين DNA داراى تعداد متفاوتى از بخش هاى ريزاقمارى هستند كه خاص خود آنهاست. بنابراين با تطبيق دادن تعداد اين بخش هاى اقمارى در چند جايگاه مى توان با درصد خطاهاى بسيار كمى شناسايى هويت انجام داد. اثر انگشت ژنتيكى در پزشكى قانونى براى تطبيق دادن نمونه هاى خون، مو، بزاق يا منى به دست آمده در محل جرم با مظنونان احتمالى و همچنين در شناسايى اجساد، تعيين ابوت يا والدين يك كودك و نيز تعيين منشا و كيفيت مواد غذايى به كار مى رود. علاوه براين اثر انگشت ژنتيكى در مطالعه جمعيت هاى حيوانات وحشى و فرضيه سازى در مورد الگوى مهاجرت هاى انسانى در دوران پيش از تاريخ مورد استفاده بوده است.
روش کار براى شناسايى DNA در يك نمونه، پس از استخراج ابتدا با استفاده از تكنيكى بيوشيميايى به نام «واكنش زنجيره اى پلى مراز» (PCR) شبيه سازى DNA تحريك مى شود و ميزان آن افزايش مى يابد به اين ترتيب مى توان از مقادير بسيار كمى از اجزاى بدنى كه حاوى سلول و در نتيجه DNA باشد براى شناسايى استفاده كرد. در معمول ترين روش شناسايى DNA، روش «پلى مرفيسم در ازاى قطعه حدى» (RFLP)، به وسيله يك آنزيم حدى (restriction enzyme) DNA به قطعاتى شكسته مى شود و سپس به وسيله الكتروفورز بر روى ژل اين قطعات از هم جدا مى شوند و به صورت نوارهايى متمركز مى شوند. سپس اين الگوى نوارى به وسيله تكنيكى به نام خشك كردن ساودرن (Southern blotting) به روى يك غشاى نايلونى منتقل مى شود. سپس با استفاده از قطعات مكمل راديو ايزوتوپ دار DNA يا پروب ها (probe) براى اتصال به توالى هاى معين DNA (كه در اين مورد همان بخش هاى ريزاقمارى هستند) به روى غشا وارد مى شود و DNA اضافى شسته مى شود. سپس يك فيلم اشعه ايكس در مجاورت غشاى نايلونى قرار داده مى شود تا الگوى راديواكتيو را ثبت كند. با ظاهر كردن فيلم الگوى مريى از نوارها ظاهر مى شود كه همان اثر انگشت ژنتيكى است.در مواردى كه شناسايى يك جسد مجهول الهويه مطرح است، از هر قسمتى از بدن كه سالم باقيمانده باشد نمونه بردارى انجام مى شود. پس از شناسايى DNA جسد، از نمونه هايى از بدن فردى كه احتمال مى رود جسد متعلق به او باشد و از قبل موجود است، مثلاً بزاق و سلول هايى كه بر روى مسواك باقى مانده است يا شانه اى كه تكه هاى پوست سر يا تارهاى مو روى آن موجود است مى توان DNA به دست آورد و با DNA جسد تطبيق داد (روش مستقيم) در مواردى كه چنين نمونه هايى در دسترس نباشد تطبيق DNA جسد با DNA بستگان نزديك فرد احتمالى انجام مى شود (روش غيرمستقيم). در روش مستقيم تطبيق بايد كامل باشد و در روش غيرمستقيم شباهت وجود دارد. روش RFLP به خصوص در موارد شناسايى تعداد زيادى از جسد مدت زيادى طول مى كشد. در اين موارد از تكنيك ديگرى به نام AFLP (پلى مرفيسم تقويت شده درازاى قطعه) استفاده مى كنند، كه از لحاظ اصولى مانند روش RFLP است اما از شيوه هاى اضافى مانند دوبار تقويت DNA و استفاده از پرايمرهاى اختصاصى سود مى جويد كه وقت و سرعت آزمايش را بالا مى برند. روش ALFP اكنون به صورت خودكار درآمده است و امكان مقايسه سريع نمونه هاى DNA افراد را مى دهد.گرچه آزمون شناسايى DNA در مواردى كه بافت هاى انسانى به حد كافى در دست باشد با دقت قابل انجام است و مى توان به خصوص با استفاده از تكنيك خودكار شده AFLP به سرعت به نتيجه رسيد. اما در محل هايى كه فاجعه هايى بزرگ به همراه آتش سوزى و تخريب رخ داده است مانند نمونه انفجار برج هاى مركز تجارت جهانى در واقعه ۱۱سپتامبر كه قربانيان به شدت سوخته اند مشكل است بتوان بافت سالمى به دست آورد كه حاوى DNA متلاشى نشده باشد، از طرف ديگر به دست آوردن بقاياى اجساد در چنين محل هايى ممكن است مدت ها طول بكشد و روند فساد جسد انجام آناليز DNA را ناممكن كند. همچنين استفاده از آب در خاموش كردن آتش باعث تخريب بيشتر DNA موجود در بافت هاى باقى مانده مى شود. در مواردى كه جسد به شدت سوخته باشد، معمولاً تنها مى توان از DNA موجود در سلول هاى استخوانى براى تعيين هويت استفاده كرد، اما در اين مورد هم كلسيم موجود در استخوان انجام تكنيك PCR براى به دست آوردن DNA را با مشكل روبه رو مى كند. در اين موارد كه از DNA هسته اى نمى توان براى شناسايى استفاده كرد، تنها راه باقيمانده آناليز DNA موجود در ميتوكندرى هاى سلول است. بيشتر DNA يك سلول درون هسته آن قرار دارد. نيمى از اين DNA از پدر، و نيم ديگر آن از مادر به ارث مى رسد؛ اما درون سيتوپلاسم سلول اندامك هايى وجود دارند كه ميتوكندرى ناميده مى شوند و در واقع موتورخانه يا محل توليد انرژى در سلول هستند. درون ميتوكندرى ها هم DNA وجود دارد، اما نكته جالب اين است كه اين DNA منحصراً از مادر به ارث مى رسد. علت اين امر به چگونگى لقاح سلول هاى جنسى مربوط مى شود. در هنگام لقاح تنها هسته اسپرم وارد تخمك مى شود و سيتوپلاسم تخمك است كه سيتوپلاسم تخم يا زيگوت بعدى را مى سازد. بنابراين ميتوكندرى هاى سلول تخم از تخمك مادر منشا مى گيرند و تنها حاوى DNA مادرى خواهند بود. تمام بستگان مادرى يك فرد DNA ميتوكندريايى مشابهى با او دارند و مى توان از اين پديده براى شناسايى هويت استفاده كرد. اما با توجه به اينكه مقدار DNA ميتوكندرى بسيار اندك است، اگر از روش هاى معمول آناليز DNA كه در بالا ذكر شد براى شناسايى آن استفاده شود، با توجه به طولانى و پيچيده بودن روند كار ۱۰ تا ۱۰۰ بار وقت بيشترى نسبت به آناليز DNA هسته اى لازم است. همين مشكل در مورد شناسايى هويت تعداد زياد قربانيان ۱۱ سپتامبر هم وجود داشت و براى حل آن دكتر فيل دانيلسن، استاديار زيست شناسى مولكولى دانشگاه دنور ايالات متحده با همكارى دكتر رابى شلتون دستيار آزمايشگاهى اش، روش جديدى را به نام DNA WAVE Analysis را ابداع كرده اند. در اين روش ديگر نيازى به تعيين توالى نوكلئوتيدها در DNA و صرف وقت زيادى براى تفسير نتايج نيست، بلكه يك تصوير فورى از كل مولكول DNA ميتوكندريايى در يك مرحله گرفته مى شود. روش كار به اين صورت است كه با استفاده از يك روش كروماتوگرافى جديد به نام DHPLC(denaturing high- preformance liquid chromatogroph) مى توان قطعات DNA براساس تفاوت هاى بسيار جزيى در توالى هاى نوكلئوتيدها از هم جدا كرد. مولكول DNA در يك محلول آبى حل مى شود و به درون ستونى فولادى پمپ مى شود و در آنجا به مهره هاى ميكروسكوپى پلاستيكى متصل مى شود. هنگامى كه تركيب شيميايى محلول DHPLC تغيير داده مى شود، DNA به اصطلاح ذوب مى شود و از اتصالات خود با مهره ها جدا مى شود. مولكول هاى DNA داراى توالى نوكلئوتيدى متفاوت در زمان هاى متفاوتى از ستون جدا مى شوند و يك نيمرخ ذوب DNA به وجود مى آيد. هرچه دو قطعه DNA توالى نوكلئوتيدى داراى شباهت بيشترى باشند در زمانى نزديك به هم از ستون جدا مى شوند و به اين ترتيب مى توان ميزان مشابهت دو مولكول DNA را تعيين كرد.گرچه در اين روش نيز در ابتدا بايد از PCR براى افزايش مقدار DNA به دست آمده استفاده كرد. اما ديگر نيازى به مرحله تعيين توالى نوكلئوتيدى كه با روش هاى معمول در مورد يك نمونه ۸۵ دقيقه طول مى كشد و آناليز و تفسير آن كه ساعت ها و روزها به طول مى انجامد، نيست. بلكه صرفاً در حدود ۴ دقيقه مى توان شباهت يا تفاوت قطعات DNA را تعيين كرد. يك مزيت ديگر اين روش كاهش هزينه ها از ۲۵۰۰ دلار به ازاى هر نمونه به ۱۰ دلار به ازاى هر نمونه است.همانطورى كه قبلاً ذكر شد به دست آوردن DNA از اجساد متلاشى شده و سوخته كار مشكلى است و معمولاً در اين موارد از استخوان ها استفاده مى شود اما استخراج DNA از استخوان ها كار مشكل و وقت گيرى است.گروه تكنولوژى Bode در آمريكا، براى حل مشكل شناسايى هويت قربانيان ۱۱ سپتامبر، روش جديد استخراج DNA و سيستم رديابى نمونه ها را به وجود آورد كه ۱۰ بار از روش هاى قبلى كارآمدتر بود.
بانك ملى اطلاعات DNA با وجود تمام اين پيشرفت هاى تكنيكى دانشمندان توانستند دو سال بعد از وقوع حادثه ۱۱ سپتامبر تنها هويت بيش از نيمى از ۲۷۸۲ قربانى را كشف كنند. براى حل مشكل تعيين هويت از چند سال قبل در آمريكا به وجود آوردن و گسترش يك بانك ملى اطلاعات DNA در جريان است تا بتوان در موارد جنايات يا حوادث با سرعت بيشترى شناسايى را انجام داد.
www.colony.ir (http://www.colony.ir)
روشهای تعیین هویت
روش هاى مختلفى در گذشته براى اين امر معمول بوده است، از جمله اثر انگشت، خصوصيات ظاهرى و بدنى مثل رنگ مو، جاى زخم، مشخصات دندان ها، يا اندازه هاى استخوان ها و... با كشف DNA راه جديدى براى تعيين هويت، حتى در مواردى كه مشخصات جسمى مثلاً در اجساد متلاشى شده قابل تعيين نيست، گشوده شد. در چند دهه اخير روش هاى شناسايى DNA تكميل شده و شناسايى سريع تر هويت را امكان پذير كرده است. به خصوص واقعه ۱۱ سپتامبر با قربانيان فراوانى كه به بار آورد و لزوم تعيين هويت آنها، باعث به وجود آمدن پيشرفت هاى تكنيكى در شيوه هاى شناسايى به وسيله DNA شد.
اثر انگشت ژنتيكى
آزمون شناسايى هويت از طريق DNA يا به اصطلاح اثر انگشت ژنتيكى در سال ۱۹۸۵به وسيله سرآلك جفريز از دانشگاه لاسيستر انگليس ابداع شد. انسان ها در بخش بزرگى از توالى هاى نوكلئوتيدهاى تشكيل دهنده DNA خود مشابهت دارند، اما بخش هايى از DNA وجود دارد كه از توالى هاى تكرارى بسيار متغير بين افراد مختلف تشكيل شده اند. اين بخش ها را اصطلاحاً بخش هاى ريزاقمارى (microsatellite) يا تكرارهاى متوالى كوتاهSTR (Shotr tandem repeats) مى نامند. او انسان غيرخويشاوند در يك جايگاه (locus) معين DNA داراى تعداد متفاوتى از بخش هاى ريزاقمارى هستند كه خاص خود آنهاست. بنابراين با تطبيق دادن تعداد اين بخش هاى اقمارى در چند جايگاه مى توان با درصد خطاهاى بسيار كمى شناسايى هويت انجام داد. اثر انگشت ژنتيكى در پزشكى قانونى براى تطبيق دادن نمونه هاى خون، مو، بزاق يا منى به دست آمده در محل جرم با مظنونان احتمالى و همچنين در شناسايى اجساد، تعيين ابوت يا والدين يك كودك و نيز تعيين منشا و كيفيت مواد غذايى به كار مى رود. علاوه براين اثر انگشت ژنتيكى در مطالعه جمعيت هاى حيوانات وحشى و فرضيه سازى در مورد الگوى مهاجرت هاى انسانى در دوران پيش از تاريخ مورد استفاده بوده است.
روش کار براى شناسايى DNA در يك نمونه، پس از استخراج ابتدا با استفاده از تكنيكى بيوشيميايى به نام «واكنش زنجيره اى پلى مراز» (PCR) شبيه سازى DNA تحريك مى شود و ميزان آن افزايش مى يابد به اين ترتيب مى توان از مقادير بسيار كمى از اجزاى بدنى كه حاوى سلول و در نتيجه DNA باشد براى شناسايى استفاده كرد. در معمول ترين روش شناسايى DNA، روش «پلى مرفيسم در ازاى قطعه حدى» (RFLP)، به وسيله يك آنزيم حدى (restriction enzyme) DNA به قطعاتى شكسته مى شود و سپس به وسيله الكتروفورز بر روى ژل اين قطعات از هم جدا مى شوند و به صورت نوارهايى متمركز مى شوند. سپس اين الگوى نوارى به وسيله تكنيكى به نام خشك كردن ساودرن (Southern blotting) به روى يك غشاى نايلونى منتقل مى شود. سپس با استفاده از قطعات مكمل راديو ايزوتوپ دار DNA يا پروب ها (probe) براى اتصال به توالى هاى معين DNA (كه در اين مورد همان بخش هاى ريزاقمارى هستند) به روى غشا وارد مى شود و DNA اضافى شسته مى شود. سپس يك فيلم اشعه ايكس در مجاورت غشاى نايلونى قرار داده مى شود تا الگوى راديواكتيو را ثبت كند. با ظاهر كردن فيلم الگوى مريى از نوارها ظاهر مى شود كه همان اثر انگشت ژنتيكى است.در مواردى كه شناسايى يك جسد مجهول الهويه مطرح است، از هر قسمتى از بدن كه سالم باقيمانده باشد نمونه بردارى انجام مى شود. پس از شناسايى DNA جسد، از نمونه هايى از بدن فردى كه احتمال مى رود جسد متعلق به او باشد و از قبل موجود است، مثلاً بزاق و سلول هايى كه بر روى مسواك باقى مانده است يا شانه اى كه تكه هاى پوست سر يا تارهاى مو روى آن موجود است مى توان DNA به دست آورد و با DNA جسد تطبيق داد (روش مستقيم) در مواردى كه چنين نمونه هايى در دسترس نباشد تطبيق DNA جسد با DNA بستگان نزديك فرد احتمالى انجام مى شود (روش غيرمستقيم). در روش مستقيم تطبيق بايد كامل باشد و در روش غيرمستقيم شباهت وجود دارد. روش RFLP به خصوص در موارد شناسايى تعداد زيادى از جسد مدت زيادى طول مى كشد. در اين موارد از تكنيك ديگرى به نام AFLP (پلى مرفيسم تقويت شده درازاى قطعه) استفاده مى كنند، كه از لحاظ اصولى مانند روش RFLP است اما از شيوه هاى اضافى مانند دوبار تقويت DNA و استفاده از پرايمرهاى اختصاصى سود مى جويد كه وقت و سرعت آزمايش را بالا مى برند. روش ALFP اكنون به صورت خودكار درآمده است و امكان مقايسه سريع نمونه هاى DNA افراد را مى دهد.گرچه آزمون شناسايى DNA در مواردى كه بافت هاى انسانى به حد كافى در دست باشد با دقت قابل انجام است و مى توان به خصوص با استفاده از تكنيك خودكار شده AFLP به سرعت به نتيجه رسيد. اما در محل هايى كه فاجعه هايى بزرگ به همراه آتش سوزى و تخريب رخ داده است مانند نمونه انفجار برج هاى مركز تجارت جهانى در واقعه ۱۱سپتامبر كه قربانيان به شدت سوخته اند مشكل است بتوان بافت سالمى به دست آورد كه حاوى DNA متلاشى نشده باشد، از طرف ديگر به دست آوردن بقاياى اجساد در چنين محل هايى ممكن است مدت ها طول بكشد و روند فساد جسد انجام آناليز DNA را ناممكن كند. همچنين استفاده از آب در خاموش كردن آتش باعث تخريب بيشتر DNA موجود در بافت هاى باقى مانده مى شود. در مواردى كه جسد به شدت سوخته باشد، معمولاً تنها مى توان از DNA موجود در سلول هاى استخوانى براى تعيين هويت استفاده كرد، اما در اين مورد هم كلسيم موجود در استخوان انجام تكنيك PCR براى به دست آوردن DNA را با مشكل روبه رو مى كند. در اين موارد كه از DNA هسته اى نمى توان براى شناسايى استفاده كرد، تنها راه باقيمانده آناليز DNA موجود در ميتوكندرى هاى سلول است. بيشتر DNA يك سلول درون هسته آن قرار دارد. نيمى از اين DNA از پدر، و نيم ديگر آن از مادر به ارث مى رسد؛ اما درون سيتوپلاسم سلول اندامك هايى وجود دارند كه ميتوكندرى ناميده مى شوند و در واقع موتورخانه يا محل توليد انرژى در سلول هستند. درون ميتوكندرى ها هم DNA وجود دارد، اما نكته جالب اين است كه اين DNA منحصراً از مادر به ارث مى رسد. علت اين امر به چگونگى لقاح سلول هاى جنسى مربوط مى شود. در هنگام لقاح تنها هسته اسپرم وارد تخمك مى شود و سيتوپلاسم تخمك است كه سيتوپلاسم تخم يا زيگوت بعدى را مى سازد. بنابراين ميتوكندرى هاى سلول تخم از تخمك مادر منشا مى گيرند و تنها حاوى DNA مادرى خواهند بود. تمام بستگان مادرى يك فرد DNA ميتوكندريايى مشابهى با او دارند و مى توان از اين پديده براى شناسايى هويت استفاده كرد. اما با توجه به اينكه مقدار DNA ميتوكندرى بسيار اندك است، اگر از روش هاى معمول آناليز DNA كه در بالا ذكر شد براى شناسايى آن استفاده شود، با توجه به طولانى و پيچيده بودن روند كار ۱۰ تا ۱۰۰ بار وقت بيشترى نسبت به آناليز DNA هسته اى لازم است. همين مشكل در مورد شناسايى هويت تعداد زياد قربانيان ۱۱ سپتامبر هم وجود داشت و براى حل آن دكتر فيل دانيلسن، استاديار زيست شناسى مولكولى دانشگاه دنور ايالات متحده با همكارى دكتر رابى شلتون دستيار آزمايشگاهى اش، روش جديدى را به نام DNA WAVE Analysis را ابداع كرده اند. در اين روش ديگر نيازى به تعيين توالى نوكلئوتيدها در DNA و صرف وقت زيادى براى تفسير نتايج نيست، بلكه يك تصوير فورى از كل مولكول DNA ميتوكندريايى در يك مرحله گرفته مى شود. روش كار به اين صورت است كه با استفاده از يك روش كروماتوگرافى جديد به نام DHPLC(denaturing high- preformance liquid chromatogroph) مى توان قطعات DNA براساس تفاوت هاى بسيار جزيى در توالى هاى نوكلئوتيدها از هم جدا كرد. مولكول DNA در يك محلول آبى حل مى شود و به درون ستونى فولادى پمپ مى شود و در آنجا به مهره هاى ميكروسكوپى پلاستيكى متصل مى شود. هنگامى كه تركيب شيميايى محلول DHPLC تغيير داده مى شود، DNA به اصطلاح ذوب مى شود و از اتصالات خود با مهره ها جدا مى شود. مولكول هاى DNA داراى توالى نوكلئوتيدى متفاوت در زمان هاى متفاوتى از ستون جدا مى شوند و يك نيمرخ ذوب DNA به وجود مى آيد. هرچه دو قطعه DNA توالى نوكلئوتيدى داراى شباهت بيشترى باشند در زمانى نزديك به هم از ستون جدا مى شوند و به اين ترتيب مى توان ميزان مشابهت دو مولكول DNA را تعيين كرد.گرچه در اين روش نيز در ابتدا بايد از PCR براى افزايش مقدار DNA به دست آمده استفاده كرد. اما ديگر نيازى به مرحله تعيين توالى نوكلئوتيدى كه با روش هاى معمول در مورد يك نمونه ۸۵ دقيقه طول مى كشد و آناليز و تفسير آن كه ساعت ها و روزها به طول مى انجامد، نيست. بلكه صرفاً در حدود ۴ دقيقه مى توان شباهت يا تفاوت قطعات DNA را تعيين كرد. يك مزيت ديگر اين روش كاهش هزينه ها از ۲۵۰۰ دلار به ازاى هر نمونه به ۱۰ دلار به ازاى هر نمونه است.همانطورى كه قبلاً ذكر شد به دست آوردن DNA از اجساد متلاشى شده و سوخته كار مشكلى است و معمولاً در اين موارد از استخوان ها استفاده مى شود اما استخراج DNA از استخوان ها كار مشكل و وقت گيرى است.گروه تكنولوژى Bode در آمريكا، براى حل مشكل شناسايى هويت قربانيان ۱۱ سپتامبر، روش جديد استخراج DNA و سيستم رديابى نمونه ها را به وجود آورد كه ۱۰ بار از روش هاى قبلى كارآمدتر بود.
بانك ملى اطلاعات DNA با وجود تمام اين پيشرفت هاى تكنيكى دانشمندان توانستند دو سال بعد از وقوع حادثه ۱۱ سپتامبر تنها هويت بيش از نيمى از ۲۷۸۲ قربانى را كشف كنند. براى حل مشكل تعيين هويت از چند سال قبل در آمريكا به وجود آوردن و گسترش يك بانك ملى اطلاعات DNA در جريان است تا بتوان در موارد جنايات يا حوادث با سرعت بيشترى شناسايى را انجام داد.
www.colony.ir (http://www.colony.ir)