*تجهیزات پزشکی و بیمارستانی*

[solinaz]

فـلـوسـيـتـومـتـر

فلوسيتومتري يك تكنولوژي بيوفيزيك بر‌اساس ليزر است كه براي جدا سازي، شمارش سلول، تشخيص بيوماركر و مهندسي پروتئين با عبوردادن سلول ها به صورت تك‌تك از مقابل ليزر، استفاده مي‌شود. اين دستگاه، امكان آناليز چندپارامتري هم‌زمان مشخصه‌هاي شيميايي و يا فيزيكي را تا هزاران ذره در هر ثانيه فراهم مي‌كند.

هدف
فـلـوسـيـتـومـتـري بـه سرعت، چندين جزء از سـلــول را بــه صــورت هـمــزمــان كـمــي كـرده و سلول‌ها و اجزاي آن‌ها را در حالت محلول (به عـنـــوان مـثــال در خــون، شـسـتـشــوي مـثــانــه، يــا ديگـر مايعات بدن) مي‌شمارد - يا در برخي از مـوارد از هـم جـدا مـي‌كند-‌. كاربردهاي باليني فـلــوسـيـتــومتـرهـا، شـامـل تشخيـص و شمـارش زيـرمـجـمـوعـه‌هاي لنفوسيت T انسان و انجام شـمـارش‌هاي افتراقي سلول‌هاي سفيد خون، مـطـالـعـات اتوآنتي بادي پلاكت، آناليز نشانگر سـطــح سـلــول، آنـالـيـز رتـيـكـولـوسـيـت و آنـالـيـز بــاكـتــريــايــي اســت. فـلــوسـيـتــومـتـرهـا همچنيـن آنيوپلوئيدي (هر گونه انحرافي از مضرب دقيقي از تعداد هاپلوئيد كروموزوم ها، چه كمتر و چه بيشتر) را با اندازه گيري داخل سلولي و آناليز DNA،‌ تشخيص مي‌دهند.
پزشكان مي‌توانند از نتايج اين مطالعات در كنار داده‌هاي باليني ديگر براي تشخيص و پيش بـيـنـي لـوسـمـي، لـنـفوم، اختلالات نقص ايمني مـانـنـد عـفـونت HIV، بيماري‌هاي خودايمني و نــاهـنـجــاري‌هــاي جـنـيـنـي و نـيـز بـراي ارزيـابـي مــوفـقـيــت فــرايـنــدهــاي پـيــونــد اسـتـفــاده كـننـد. داده‌هاي فلوسيتومتري همچنين در تحقيقات ســـرطـــانـــي بــراي انــدازه‌گـيــري تـكـثـيــر، انـجــام ســنــجــــش‌هــــاي انــكــــوپــــروتــئــيـ ـــن و ارزيـــابـــي مـقـــاومـــت‌هـــاي داروئـــي اسـتـفــاده مــي‌شــونــد. فلوسيتومتري به صورت معمول در تشخيص اخـتـــلالات، بـــه ويــژه ســرطــان خــون اسـتـفــاده مـــي‌شـــود؛ امـــا كـــاربـــردهـــاي زيــاد ديـگــري در تحقيقـات پايه، عمل باليني و آزمايشات باليني هم دارد. يك كاربرد معمول آن مرتب كردن فيزيكي ذرات بر اساس خواص آن‌ها است به نحوي كه جمعيت موردنظر خالص‌سازي شود.

تاريخچه
مختـرع اولين نمونه‌هاي فلوسيتومترهاي امروزه به ويژه جدا كننده‌هاي سلول، Mack Fulwyler بود. وي مقاله مرتبط با اين موضوع را در 1965 منتشر كرد. اولين دستگاه فلوسيتومتر بر اساس فلورسنس در 1968 توسط Wolfgang Gohde از دانشگاه مونستر توسعه يافت. در آن زمان، دانشمندان روش‌هاي جذبي را به روش‌هاي فلورسنس ترجيح مي‌دادند. خيلي طول نكشيد كه دستگاه‌هاي فلوسيتومتر شامل سيتوفلوگراف توسعه يافتند.
عنوان فناوري
اسم اصلي فناوري فلوسيتومتر، "سيتوفتومتري پالس" بود. در پنجمين كنفرانس بنياد مهندسي امريكا روي سيتولوژي اتوماتيك در فلوريدا در 1976 توافق شد كه همه از اسم فلوسيتومتر استفاده كنند و اين نام به سرعت مرسوم شد.
اصول عملكرد
فلوسيتومتري شامل سه سيستم پايه است: جزء مايع كه سلول‌ها را به محفظه آناليز منتقل مي‌كند، سيستم نوري با وسايل تشخيص و آناليز داده و اجزاي نمايشگر (شكل 1.) يك پرتو نوري تك طول موج (معمولا نور ليزر)، به سمت يك جريان مايع متمركز شده به صورت هيدروديناميك هدايت مي‌شود. تعدادي آشكارساز پس از نقطه برخورد جريان مايع با ليزر قرار دارند: يكي در امتداد شعاع نوري (پراكنده كننده فروارد forward scatter يا FSC) و چند تا عمود بر آن( پراكنده كننده جانبي side scatter يا SSC )و يك يا چند آشكارساز فلورسنس. هر ذره معلق با اندازه 2/0‌ تا 150 ميكرومتر كه از شعاع نور عبور مي‌كند نور ليزر را پراكنده مي‌كند . مواد شيميايي فلورسنت موجود در ذره يا متصل شده به آن، مي‌توانند تحريك شده و نوري با طول موج بيشتر از منبع نوري ساطع كنند. اين تركيب از نور فلورسنت و نور پراكنده شده، توسط آشكارسازها و با تحليل نوسانات (يكي براي هر پيك انتشار فلورسنت) تشخيص داده مي‌شود و سپس مي‌توان انواع مختلفي از اطلاعات در مورد ساختار فيزيكي و شيميايي هر ذره مجزا را استخراج كرد. FSC با حجم سلول همبسته است و SSC وابسته به پيچيدگي داخلي ذره (يعني شكل هسته، مقدار و نوع دانه ها در سيتوپلاسم يا زبري غشا) است. چرا كه نور در اثر برخورد با اجزاي داخلي سلول پراكنده مي‌شود. برخي از فلوسيتومترهاي موجود در بازار، نياز به فلورسنس ندارند و تنها از پراكنده كننده‌هاي نور براي اندازه گيري استفاده مي‌كنند. بيشتر فلوسيتومترها، تصاويري از فلورسنس هر سلول، نور پراكنده شده و نور منتقل شده تشكيل مي‌دهند.
ايمنوفلورسنس پايه اغلب سنجش‌هاي سيتومتريك فلو است. اين تكنيك متكي بر اسـتـفــاده از رنـگ‌هـا و فلئـوروكـروم‌هـا (flurochromes) بـراي نشـانـه گـذاري كـردن ساختارهاي خاص بر روي سلول است. فلئوروكروم به اجزاي خاصي در سلول مانند DNA، RNA يا پروتئين‌ها (آنزيم‌هاي سلولي، نشانگرهاي سطح غشا، ديگر آنتي ژن ها) متصل مي‌شود. زماني كه در معرض نوري با طول موج خاص قرار مي‌گيرند، اين فلئوروكروم‌ها، فلورسنت مي‌شوند و نور را با طول موج بيشتر از نور تابشي كه جذب مي‌كنند ساطع خواهند كرد.
دو يـا چـند فلئوروكروم مي‌توانند به صورت هم‌زمان براي برچسب گذاري دو تركيب سلولي (به عنوان مثال يكي براي برچسب گذاري DNA هسته و ديگري براي برچسب گذاري آنزيم‌هاي سيتوپلاسمي) استفاده شوند. به علاوه چند فلئوروكروم مي‌توانند براي برچسب گذاري ماده سلولي مشابهي استفاده شوند. اجزاي سلولي مي‌توانند هم چنين با رنگ ametachromatic برچسب گذاري شوند.
سلول‌هايي كه قرار است آناليز شوند با معرف‌هاي خاصي تركيب شده و سپس به صورت اتوماتيك در يك جريان مايع معلق مي‌شوند. اين جريان در يك محيط مايع تـحـت فـشـار بـه مـحـفـظـه آنـالـيـز مـنـتـقـل مي‌شود. قبل از ورود به محفظه، به صورت هـيـدروديـنـامـيك متمركز شده و يك جريان لايه اي و آرام ايجاد مي‌كند. اين باعث مي‌شود كه سلول‌ها به يك مسير دقيقا تك‌سلولي از ناحيه سنجش نوري عبور كنند. در اين ناحيه، سيستم تشخيص، هر سلول را با نرخ شمارش تا 10 هزار سلول در ثانيه آناليز مي‌كند.
همين طور كه سلول‌ها از محفظه آناليز(فلوسل) عبور مي‌ كنند، يك پرتو نوري تك رنگ با چگالي بالا از يك ليزر به آن‌ها تابانده مي‌شوند. طول موج تابيده شده توسط ليزر بايد در بازه انرژي تحريكي رنگ/ فلئوروكروم‌هاي انتخابي قرار بگيرد تا فلورسنت رخ دهد. مرسوم ترين ليزرها، ليزرهاي آرگون هستند كه يك تابش قوي در طول موج nm 488 مي‌كنند. هليم-نئون nm( 633)، هليم-كاديم nm( 325) و ديود قرمز nm( 635) انواع ديگري از ليزرها هستند كه معمولا در فلوسيتومتري استفاده مي‌شوند.
علاوه بر انطباق انرژي، مهم است كه طول موج تابيده شده توسط ليزر از طول موج انـرژي فـلـورسـانـس قـابل تميز باشد. (جدول 1 را براي مشاهده ليستي از رنگ‌ها و fluorochromهاي مرسوم ببينيد.)
هـمـيـن طـور كـه نـور از داخـل جـريـان سـلـول‌هـا مي‌گذرد، دستگاه، فلورسنس و پراكندگي نوري را كه تابيده مي‌شود اندازه گيري مي‌كند. پراكندگي نور معياري از مقدار نور ليزر منعكس شده و شكسته شده از طريق سلول در مقايسه با نور منتشر شده از رنگ‌هاي فلورسنت است. شدت پراكندگي نور در جهت مقابل (fSc) معمولا متناسب با سايز سلول است؛ در حالي كه پراكندگي نور در زاويه عمود به نور تابيده شده، معمولا با ساختارهاي داخلي سلول (به عنوان مثال نسبت هسته به سيتوپلاسم، دانه دانه بودن سيتوپلاسم) مرتبط است. پراكندگي نور مي‌تواند براي تفكيك سلول‌هاي زنده از مرده در يك جمعيت همگن از لنفوسيت‌ها استفاده شود.
مجموعه نور فلورسنت ساطع شده از رشته نمونه معمولا در زاويه 90 درجه نسبت به باريكه نور تابيده شده قرار دارد. تشخيص فلورسانس بر اساس اختصاصي بودن يك رنـگ فـلوورسنت به قسمت منحصربه فردي از سلول است. اين تعامل به تحليل و جـداسـازي زيـرجـمـعـيـت‌هـاي لـنـفـوسـيـت، انـدازه گـيـري زيـرمجموعه اي از جمعيت‌ لنفوسيت‌هاي T، ارزيابي كينتيك سلولي در جمعيت‌هاي سلولي نئوپلاستيك و طبيعي، انـــدازه گـيـــري آنـتـــي‌ژن‌هـــاي سـطـحـــي سـلــول (نشـانگـرهاي تومور، گيرنده ها)، و جداسازي سلـول‌هـا بر اساس مشخصه‌هاي غشاي آن‌ها كمك مي‌كند.
فـلــوسـيـتــومـتــرهــاي چـنــد لـيـزري در آنـاليـز سيگنال‌هاي فلورسانسي كه از لحاظ طول موج تحريك جدا از هم هستند استفاده مي شوند. در اين حالت، مي‌توان سيگنال‌هاي جداگانه را با استفاده از نيمه آينه‌ها در جهات مختلف هدايت و ارسال كرد به نحوي كه هيچ تداخل سيگنالي رخ ندهد. با اين حال در برخي دستگاه‌ها زماني كـه نور سلول را ترك مي‌كند، تمام سيگنال‌ها تركيب مي‌شوند. اين متكي بهچيدمان آينه‌هاي دورنگ نما (dichroic) و فيلترهاي جداسازي و اصلاح سيگنال‌ها است. آينه‌هاي دورنگ‌نما بـراي منعكس كردن نور بالاي يك طول موج خــاص و در عـيــن حــال ردكــردن نـور بـا طـول موج‌هاي پايين تر از آن حد، طراحي شده‌اند. مــي‌تـوان هميـن طـور كـه نـور وارد لامـپ‌هـاي تقويت‌كننده‌ نوري(pmt) مي‌شود، فيلتر كردن بيشتري را هم اعمال كرد. اين آشكارسازهاي pmt نــور ســاطــع شـده تـوسـط سـلـول‌هـا را بـه پالس‌هاي الكترونيكي تبديل مي‌كنند و سپس اين پالس‌ها براي ديجيتال شدن و تحليل‌هاي كامپيوتري، تقويت مي‌شوند.
بـرخـي از فلوسيتومترها، قابليت جداسازي سلول(Sorting) را دارند و مي‌توانند انواع خاصي از سلول‌ها در نمونه را جداسازي و تحليل كنند. هــم‌زمــان بــا خــروج رشـتــه نـمــونــه از مـحـفظـه تــشــخــيـــص، يـــك كـــريــســتــال پـيــزوالـكـتــريــك (كريستالي كه در آن، نيروي مكانيكي متناسب با ولتاژ اعمال شده توليد مي‌شود)، ارتعاش كرده و جـريـان يـكـنواخت نمونه را به يك سري قطره تبديل مي كند كه از بين دو صفحه انحراف قطبي شـده عـبور مي‌كنند. بر اساس انتخاب از پيش تعيين شده، سلول‌هاي مجزا كه بار خالص مثبت يا بار خالص منفي دارند به سمت مخزن جمع آوري مــربــوطــه مـنـحــرف شـده و بـقـيـه مـايـع و سلول‌ها دور ريخته مي‌شوند.
يك نوع ديگر فلوسيتومتر جدا كننده سلول يك مكانيزم مكانيكي براي جدا كردن دارد كه در آن لوله گيرنده سلول هايي كه خارج مي شوند، بـــه سـمـــت چـــپ و راســـت حـــركـــت كــرده و سلول‌هاي موردنظر را مي گيرد. اين نوع تكنولوژي مرتب سازي وابسته به تشكيل قطره نيست و در يك محيط بسته اتفاق مي‌افتد و بنابراين تشكيل بخارات و ريسك آلودگي ناشي از نمونه‌هاي خطرناك بيو را كم مي‌كند.
فلوسيتومترهاي مدرن مي‌توانند چند هزار ذره را در هر ثانيه به صورت زمان حقيقي تحليـل كننـد و مي‌توانند به صورت فعال، ذرات با ويژگي‌هاي خاص را جدا كنند. فلـوسيتومتر مشابه ميكروسكوپ است، با اين تفاوت كه به جاي توليد تصويري از سلول، به صورت اتوماتيك پارامترهاي مجموعه با خروجي بالا (براي تعداد زيادي سلول) را كمي مي‌كند. براي آناليز بافت‌هاي جامد، بايد آن‌ها را ابتدا در حالت محلول تك سلولي آماده كرد.
فلوسيتومتر پنج جزء اصلي دارد:
فلوسل: كه سلول‌ها را در مايع هم راستا مي‌كند به نحوي كه به صورت تك به تك پشت سر هم از مسير پرتو نوري عبور كنند.
سيستم اپتيكي و ليزر : كه معمولا از سيستم‌هاي نوري و اندازه گيري امپدانس (يا هدايت- )لامپ‌ها (جيوه، زنون)؛ ليزرهاي با توان بالا و خنك شونده با آب (آرگون، كريپتون، ليزر رنگي)؛ ليزرهاي توان پائين خنك شونده با هوا (آرگون nm 488، هليم-نئون قرمز nm 633، هليم نئون سبز، (HeCd)UV)؛ ليزرهاي ديودي (سبز، قرمز، بنفش و آبي) كه سيگنال‌هاي نوري مي‌دهند.
آشكارساز و سيستم تبديل آنالوگ به ديجيتال: كه FSC و SSC و نيز سيگنال‌هاي فلـورسنـس نـور را بـه سيگنال‌هاي الكتريكي (قابل پردازش توسط كامپيوتر) تبديل مي‌كنند.
يك سيستم تقويت الكترونيكي: خطي يا لگاريتمي
يك كامپيوتر براي آناليز سيگنال ها
دريافت سيگنال سلول‌ها
جمع آوري سيگنال از نمونه‌ها با استفاده از فلوسيتومتر، دريافت يا Acquisitionناميده مي‌شود. دريافت، به واسطه ي كامپيوتري كه به صورت فيزيكي به فلوسيتومتر متصل شده است و نرم افزاري كه واسطه ديجيتال با سيتومتر است انجام مي‌شود. نرم‌افزار مي‌تواند پارامترها (مانند ولتاژ، جبرانسازي و غيره) را براي نمونه در حال تست تنظيم كند و همچنين براي اطمينان از اين كه پارامترها به صورت صحيح تنظيم شده اند، مي‌تواند در نمايش اطلاعات اوليه سلول همزمان با اخذ داده‌هاي سلول كمك كند. كلا فلوسيتومترهاي اوليه، دستگاه‌هاي تجربي بودند؛ اما پيشرفت‌هاي تكنولوژيك امكان اسـتفـاده وسيـع از آن‌هـا بـراي اهـداف بـالينـي و تحقيقاتي را فراهم كرده اند. به خاطر اين توسعه، بازار قابل توجهي مربوط به ابزار دقيق، نرم افزار آناليز و نيز معرف‌هاي مورد استفـاده در مـرحلـه دريـافـت مـاننـد آنتي بادي‌هاي برچسب گذاري شده به صورت فلورسنت ايجاد شده است.
دسـتـگـــاه‌هـــاي مــدرن مـعـمــولا چـنــد لـيـزر و آشكارساز فلورسنس دارند. ركورد فعلي براي يك دستگاه تجاري چهار ليزر و 18 آشكارساز فـلــورسـنــس اســت. افــزايــش تـعــداد لـيــزرهــا و آشـكــارســازهــا، امكـان بـرچسـب گـذاري چنـد آنتي‌بادي به صورت همزمان را فراهم مي‌كند و مـي‌تـوانـد با دقت بيشتري جمعيت هدف را با مـــاركــرهــاي فـنـــوتـيـــپ آن‌هـــا شـنـــاســـايـــي كـنـــد. دســتــگــــاه‌هــــاي خــــاصــــي حــتــــي مـــي‌تــوانـنــد از سلول‌هاي مجزا هم تصاوير ديجيتال تهيه كنند و بــه ايــن وسـيـلــه امـكــان آنــالـيــز مـكــان سـيـگـنـال فـلــورسـنــت داخــل يــا روي سطـح سلـول‌هـا را مي‌دهد.
آناليز داده
داده توليدشده با فلوسيتومترها را مي‌توان با رسم يك هيستوگرام يك بعدي نمايش داد يا اين كه به صورت دو يا حتي سه بعدي رسم كـرد. نـواحـي روي اين نمودارها را مي‌توان بر اساس شــــدت فــلــــورســنــــس، بــــا ايــجــــاد يـــك ســـري زيرمجموعه به نام gate به صورت متوالي جــدا كـــرد. پــروتكـل‌هـاي خـاصـي بـراي ايجـاد gateها براي اهداف باليني و تشخيصي به ويژه در رابطه با هماتولوژي وجود دارند.
نمـودارهـا اغلـب بـا مقيـاس لگـاريتمـي رسـم مي‌شوند. از آنجا كه طيف‌هاي تابشي نورهاي فـلـورسـنـت مـخـتـلـف بـا هـم هـمـپـوشـاني دارند سـيـگـنـال‌هـا در آشـكـارسـازهـا بـايـد بـه صورت الكترونيكي و نيز محاسباتي جبرانسازي شوند. داده جمع آوري شده با استفاده از فلوسيتومتر را مـــي‌تـــوان بـــا نـــرم افــزارهــايــي مــانـنــد WinMDI(يـك نرم‌افزار رايگان)، Flowjo، FCS Express، VenturiOne، CellQuest Pro يا Cytospec تحليل كرد. بعد از جمع آوري داده، نيازي نيست كه اتـصال به فلوسيتومتر باقي بماند. به اين دليل، آناليز معمولا روي يك كامپيوتر جداگانه انجام مي‌شود.
آناليز محاسباتي
پيشـرفـت‌هـاي اخيـر در شنـاسـايي اتوماتيك جـمـعـيـــت سـلـــولـــي مـــورد نـظــر بــا اسـتـفــاده از روش‌هاي محاسباتي، روش ديگري به عنوان جـايگـزيـن براي استراتژي سنتي gate پيشنهـاد مـــي‌كـنـنــد. سيستــم‌هـاي شنـاسـايـي اتـومـاتيـك، مي‌توانند به يافتن جمعيت‌هاي پنهان و كمياب كمك كنند.
برچسب‌ها
بـرچسـب‌هـاي فلـورسنـت: بـازه وسيعـي از فلئـوروفـورهـا مي‌توانند به عنوان برچسب در فلوسيتومتري استفاده شوند. فلئوروفورها يا به صورت ساده "فلئورها"، معمولا به يك آنتي بادي متصل مي‌شوند كه يك ويژگي هدف را داخل يا روي سلول شناسايي مي‌كند. همچنين مي‌توانند به يك ذره شيميايي كه ميل تركيبي با غشاي سلول يا ساختار ديگري در سلول دارد، متصل شوند. هر فلئوروفور، يك طول موج تابش و پيك تحريك خاص دارد و طيف‌هاي انتشار اغلب با هم همپوشاني دارند. در نتيجه تركيب برچسب‌هايي كه مي‌توانند استفاده شوند وابسته به طول موج لامپ (ها) يا لـيــزر(هــا)ي مــورد اسـتـفــاده بــراي بــرانـگـيـخـتــن فـلـئــوروكــوروم‌هــا و نـيــز وابـستـه بـه آشكارسازهاي موجود است. ماكزيمم تعداد برچسب‌هاي فلورسنت قابل تفكيك حـدود 17 تـا 18 عـدد است و اين سطـح پيچيـدگـي بـاعـث مـي‌شـود نيـاز بـه بهينـه سـازي پـرزحـمتي براي محدودكردن اغـتـشــاشــات و نـيــز نـيــاز بــه الـگـوريتـم‌هـاي deconvolution پيچيـده بـراي جـداسـازي طيف‌هايي كه با هم تداخل دارند، باشد.
نقاط كوانتومي: نقاط كوانتومي به خاطر پيك‌هاي انتشار باريك تر، گاهي به جاي فلئوروفورهاي سنتي استفاده مي‌شوند.
َ‌برچسب گذاري ايزوتوپ: يك روش براي غلبه بر محدوديت برچسب گذاري فلورسنت، متصل كردن ايزوتوپ‌هاي لانتانيدها (lanthanide) به آنتي بادي‌ها است. اين روش از نظر تئوري مي‌تواند امكان استفاده از 40 تا 60 برچسب قابل تمايز را فراهم كند و عملا كاربري آن، براي 30 برچسب نشان داده شده است. سلول‌ها وارد پلاسما شـده، يـونـيـزه مي‌شوند و اسپكترومتري جرمي براي شناسايي ايزوتوپ‌هاي مرتبط استفاده مي‌شوند. گرچه اين روش امكان استفاده از تعداد بيشتري برچسب را فراهم مي‌كند در حال حاضر ظرفيت عبوردهي كمتري نسبت به فلوسيتومتري سنتي دارد. همچنين سلول‌هاي آناليزشده را از بين مي‌برد و لذا امكان ريكاور كردن آن‌ها با جدا سازي وجود ندارد.
پارامترهاي اندازه گيري
در ادامه ليستي از اين پارامترها نوشته شده است كه البته دائما اين ليست در حال توسعه است:
‌تاييد تشخيص لوسمي لنفوسيتي مزمن
‌پيچيدگي مورفولوژيك و حجم سلول ها
‌رنگدانه‌هاي سلول مانند كلروفيل يا phycoerythrin
‌محتواي كلي DNA سيكل سلولي، كينتيك سلولي، تكثير، پلوئيدي، آنيوپلوئيدي و غيره)
‌محتواي كلي RNA
‌تغييرات تعداد كپي DNA(با تكنولوژي BACs-on-Beads يا Flow-FISH)
‌مرتب سازي و آناليز كروموزوم (ايجاد كتابخانه، رنگ كردن كروموزوم)
‌بخش بندي و بيان پروتئين
‌تغييرات پروتئين، فسفوپروتئين ها
‌مـحـصــولات تــراريـختـه (transgenic) در داخل بدن، به ويژه پروتئين فلئورسنت سبز يا ديگر پروتئين‌هاي فلئورسنت مرتبط
‌آنتـي ژن‌هـاي سطح سلول (خوشه اي از نشانگرهاي افتراق (CD))
‌آنــتـــــي ژن‌هـــــاي درون ســلــــولــــي (انــــواع cytokines، واسطه‌هاي ثانويه، غيره.)
‌آنتي ژن‌هاي هسته اي
‌فعاليت آنزيمي
PH، كـلـسـيـم يـونيـزه شـده داخـل سلـولـي، منيزيم، پتانسيل غشا
‌سياليت غشا
‌آپوپتوز (كمي سازي، اندازه گيري تخريب DNA، پـتـانـسـيـل غـشـاي مـيـتـوكندري، تغييرات نفوذپذيري،فعاليت (caspase)
‌زيست پذيري سلول
‌مــانـيـتــور كــردن نـفــوذپـذيـري الـكـتـريـكـي سلول‌ها
‌بـــــررســـــي مـــشــخــصــــه‌هــــاي مــقــــاومــــت چنددارويي (MDR) در سلول‌هاي سرطاني
Glutathione
!تــــركــيــبــــات ويــــروســــي (آنــتــــي ژن‌هـــاي سطحDNA/، غيره.)
"چــســبــنــــدگـــي سـلـــول (بـــه عـنـــوان مـثـــال چسبندگي سلول پاتوژن-ميزبان)
كاربردها
ايـن تـكـنـولـوژي كـاربـردهـايـي در زمينه‌هاي مـخـتـلـف شامل بيولوژي مولكولي، پاتولوژي، ايـمـنـولـوژي، زيـسـت شـنـاسي گياهي و زيست شـنـاسـي دريـايـي دارد. كـاربـردهـاي وسيعي در پـــزشــكـــي (بــه ويــژه در پـيــونــد، هـمــاتــولــوژي، ايـــمـــنـــــولــــوژي تــــومــــور و شــيــمــــي درمــــانــــي، تـشـخـيـص‌هـاي پـيـش از تولد، ژنتيك و مرتب سازي اسپرم براي انتخاب جنسيت از قبل) دارد. در زيـسـت شـنـاسـي دريـايـي، مـي‌تـوان خواص اتوفلورسنت پلانكتون فتوسنتز را با فلوسيتومتر به منظور توصيف ساختار اجتماعي و فراواني اســتــخــــراج كــــرد. در مــهــنــــدســــي پـــروتــئــيـــن، فلوسيتومتر در تركيب با نمايشگر باكتريائي و نـمــايـشـگــر مـخـمــر بـراي شنـاسـايـي گـونـه‌هـاي پـــروتـئـيـنــي cell surface-displayed بــا خــواص موردنظر استفاده مي‌شود.
مشكلات گزارش شده
تحليل با استفاده از فلوسيتومتري نيازمند اين اسـت كـه سـلـول‌هـا به صورت مجزا در حالت محلول قرار داشته باشند (يعني هر سلول به وسيله يك ماتريس مايع احاطه شده باشد، بدون اين كه سلول‌هاي همسايه در كنار آن جمع شده باشند.) خون، مغز استخوان و كشت‌هاي سلولي به راحتي، محلول‌هاي تك سلولي تشكيل مي‌دهند. اما بافت جامد غيرلنفوئيد نياز به پردازش با استفاده از آنزيم يا عوامل )chelating( براي از بين بردن پيوندهاي بين سلول‌ها دارد. متاسفانه اين پردازش، باقيمانده‌هاي سلولي (استروماي سلولي، سيتو پلاسم و نوكلئوپلاسم آزاد) هم توليد مي‌كند كه در طول تحليل، اغتشاش ايجاد مي‌كنند. با اين وجود مي‌توان با استفاده از تمايز و جبران الكترونيكي داده ها، تاثير اين باقيمانده‌ها روي نتايج نهائي را از بين برد.
براي اين كه فلوسيتومتر بتواند به صورت موثري كار كند، نقطه تقاطع پرتو ليزر و جبران سلولي بايد در رابطه با مسير تشخيص، دقيقا حفظ شود. اين پيكربندي خاص نياز دارد كه عملكرد به صورت روزانه بررسي شود تا از عملكرد مناسب دستگاه، اطمينان حاصل شود.


ملاحظات ديگر
از آنجا كه عملكرد فلوسيتومتر نياز به آموزش خــاص دارد، تـوليـدكننـدگـان معمـولا آمـــوزش رايگـان ارائـه مـي‌دهنـد. بـا ايـن وجـود اپـــراتـــورهـــا بـــراي حـــرفـــه اي شـــدن، نــيـــاز بـــه آمـوزش‌هـاي اضـافـي و تجـربـه طـولانـي كار با دستگاه را دارند. بـــــــه هــــمــــيــــــن دلـــيــــــل در بــــــرخــــــي مــــــراكــــــز، تـكـنـــولـــوژيـســـت‌ه� �ــاي خـــاصـــي بـــراي كــار بــا فــلــــوســيـتـــومـتـــ ر در نـظـــر گـــرفـتـــه مـــي‌شـــونـــد. بيمارستان‌ها همچنين بايد در اين زمينه كه نتايج چگونه مورد استفاده قرار خواهند گرفت و اين كـه چـه تست‌هايي بايد انجام شود، با پزشكان ارتـبــاط داشـتــه بــاشـنــد. در هـنـگــام خــريـد يـك فلـوسيتـومتـر، بـايد نيازمندي‌هاي پرسنل را نيز مدنظر قرار داد (به عنوان مثال آيا نياز به استخدام يك پزشك يا تكنولوژيست باتجربه هست؟.)
قيمت دستگاه بسته به سخت افزار و نرم افزار كــامـپـيــوتــر، بـرنـامـه‌هـاي مـوجـود در دستگـاه و موجود بودن واحدهاي آماده سازي اتوماتيك نمونه و ديگر لوازم جانبي متفاوت است. از آنجا كـه مـدل‌هـاي بـا قـابـلـيـت جـدا سازي سلول و بدونآن، موجود هستند آزمايشگاه‌ها بايد تعيين كنند كه آيا به اين قابليت در حال حاضر نياز دارند يا ممكن است درآينده به آن نياز پيدا كنند. قيمت ايـن دسـتـگـاه‌هـا بـسـتـه بـه گزينه‌ها و پيكربندي دستگاه متغير است.
از آنـجــا كــه فـلـوسـيـتـومـتـرهـا، دسـتـگـاه‌هـاي open-platform اي هستند، معرف‌ها را مي‌توان از تــولـيــدكـنـنــدگــان مـتـنــوعــي خــريــداري كــرد معيارهاي ديگري كه در خريد بايد در نظر گرفته شوند گزينه‌هاي مربوط به چاپگر و كامپيوتر، گزينه‌هاي نرم افزار DNA و ايمنوفلورسانس و ويژگي هايي مانند محدودكردن خطرات بيو و سردسازي هستند.
در ادامه يك آناليز PV/LCC نمونه در آمريكا براي محاسبه هزيئه تهيه يك فلوسيتومتر نوشته شده است:

فرضيات
هزينه‌هاي عملكردي براي سال‌هاي يك تا پنج در نظر گرفته مي‌شوند.
ضريب كاهش دلار %5/3‌ است.
نرخ تورم براي هزينه‌هاي پشتيباني 3% و براي مواد مصرفي 3% است.
هزينه‌هاي Capital
سيستم= 140 هزار دلار
كل هزينه‌هاي Capital = 140 هزار دلار
هزينه‌هاي عملكردي
قرارداد سرويس، دو تا پنج سال = 14 هزار دلار در سال
دستمزد و هزينه‌ها براي يك FTE = 40 هزار دلار در سال
معرف‌ها = 105 هزار دلار در سال
كل هزينه‌هاي عملكردي = 145 هزار دلار براي سال اول؛ 159 هزار دلار براي سال دوم تا پنجم.
$127‚805PV=
هزينه‌هاي ديگري كه در آناليز بالا وارد نشده اند و بايد براي برنامه ريزي بودجه در نظر گرفته شوند شامل موارد مرتبط با گزينه‌هاي زير مي‌شوند:
ارتقاء نرم افزار كه در گارانتي يا در قرارداد سرويس در نظر گرفته نشده اند.
Utilities
Contributions to overhead
همان طور كه در مثال بالا از آناليز PV/LCC نشان داده شد، هزينه خريد اوليه فقط كـســري از هـزينـه كلـي عملكـرد در طـول پنـج سـال اسـت. بنـابـرايـن بـه جـاي ايـن كـه تصميم‌گيري در مورد خريد تنها بر اساس هزينه اوليه يك سيستم فلوسيتومتر گرفته شود، خريداران بايد هزينه‌هاي عملكردي در طول عمر آن را نيز در نظر گرفته و بررسي كنند.
مراحل توسعه
كـاربـردهـاي بـالـيـنـي فـلـوسـيـتـومـتـر در اواسـط دهـه 1970 شـروع شـد. پيشرفت در سيستم‌هاي الكترونيكي و افزوده شدن ميكروپروسسورها به فلوسيتومترهاي فعلي امكان ارزيابي حداقل هشت تا نه پارامتر سلولي را مي‌دهد؛ دو پارامتر پراكندگي نور، سه يا چهار پارامتر chromogenic و سه پارامتر ايمنوفلورسانس.
به علاوه امروزه بسياري از فلوسيتومترها، مجهز به دو يا چند ليزر هستند كه مي‌توانند بـراي بـرانـگـيـختن يك بازه از رنگ‌ها و فلئوروكروم‌ها استفاده شوند. اين پيشرفت تكنولوژي براي اپراتورها امكان استفاده همزمان از 11 رنگ ايمنوفلورسانس را فراهم مي‌كند.
به منظور بهبود دادن كلاس بندي، دريافت و آناليز داده، نرم افزار آناليز داده به طور دائم به روز شده و توسعه داده مي‌شود. به علاوه استفاده از سيستم‌هاي آماده سازي اتـومـاتيك نمونه، موجب استانداردسازي آماده سازي و فراهم كردن كنترل كيفيت خوب مي‌شود و زمان آماده سازي را از يك تا دو ساعت به 10‌دقيقه يا كمتر كاهش مـي‌دهـد. محققـان نشان داده‌اند كه تكنولوژي فلوسيتومتر با استفاده از منابع نوري ارزان قيمت هــلــيــــم-نــئـــون و تـكـنـيـــك‌هـــاي رنـــگ آمـيـــزي فـلـورسـانـس مي‌توانند ابزاري حساس، از نظر هزينه مقرون به صرفه و سريع براي تشخيص، توصيف و شناسايي باكتري‌ها باشند. ‌امروزه، يــكـــي از مـــرســوم تــريــن كــاربــردهــاي بــالـيـنــي فلوسيتومتر انجام شمارش لنفوسيت 8/CD4CD در خــون محيطـي از بيمـاران بـا HIV مثبت براي سـطــح بـنــدي و بـراي نـظـارت دوره اي اســت. تـحـقيقـاتـي بـا هـدف مطـالعـه پلاكت‌ها به ويـژه بــــراي تــشــخــيـــص آنــتـــي بـــادي ضـــدپـــلاكــتــي مـــرتــبـــط بــا بـيـمــاري‌هــاي خــود ايـمـنــي انـجــام مـي‌شـونـد. يـكـي ديـگـر از زمينه‌هاي تحقيقاتي مورد علاقه، فعال سازي پلاكت است كه زماني كه خون با پروتز رگ يا سطح يك وسيله پزشكي مـانـنـد واحـد هـمودياليز يا باي پس شش-قلب تـمـاس پـيدا مي‌كند، اتفاق مي‌افتد. آناليز DNA سـلــول تــومـور و نـيـز بـسـيـاري از كـاربـردهـاي ميكروبيولوژي باليني ديگر براي فلوسيتومتر با افزايش مداوم استفاده از اين دستگاه، در حال بررسي است.
محققـان شـروع به بررسي امكان استفاده از فلوسيتومترها به عنوان آشكارسازهاي ويروس كـــرده انـــد. ويـــروس‌هــا بـسـيــار كــوچــك‌تــر از بـاكتري‌ها يا سلول‌هاي سرطاني با قطر 100 تا 250 نــانــومـتــر هـسـتـنــد. انـدازه كـوچـك آن هـا، تفكيك كردن سيگنال‌هاي نور پراكنده شده از آن‌هـا از نـويـز پـس زمـيـنـه را مـشـكـل مـي‌سازد. هـــم‌زمـــان بـــا تـــلاش مــحـقـقــان بــراي افــزايــش حساسيت فلوسيتومترها، نقش اين دستگاه‌ها به عنوان آشكارساز ويروس پررنگ تر مي‌شود.


منبع:نشریه مهندسی پزشکی شماره ۱۳۹وپزشکیی بالینی