یار همیشگی
پاسخ : تکنیک های سلولی و مولکولی مورد استفاده در مراکز تحقیقاتی
منظرم از این سوالات اینه که آیا ما می تونیم این دستگاه را تولید کنیم یا ما تکنولوژی این نوع از دستگاه ها را نداریم.
مهمترين لذت در زندگي، كمك به سايرين براي برنده شدن است. حتي اگر به قيمت آهسته تر رفتن و تغيير در نتيجه مسابقه اي باشد كه ما در آن شركت داريم
دوست آشنا
پاسخ : تکنیک های سلولی و مولکولی مورد استفاده در مراکز تحقیقاتی
نه متاسفانه منبع تولید حرارت رو نمی دونم.ولی باید حرارت تا حدود 105 درجه بالا بره و ابتدا درب دستگاه رو گرم کنه.دستگاه طوری تعبیه شده که وقتی درب اون بسته میشه درب کاملا روی درب میکروتیوبها قرار میگیره و با محکم کردن درب دستگاه از تبخیر محلولها در معرض گرمای بالا جلوگیری میشه.این درب باید تا حدود105 درجه گرم بشه.نوشته اصلی توسط majhol
درطوفانهای زندگی باخدا بودن بهتر از ناخدا بودن است
می رسد روزی که بی من روزها را سر کنی
می رسد روزی که مرگ عشق را باور کنی
می رسد روزی که تنها در کنار عکس من
نامه های کهنه ام را مو به مو از بر کنی
دوست آشنا
پاسخ : تکنیک های سلولی و مولکولی مورد استفاده در مراکز تحقیقاتی
منبع تولید حرارت تو دستگاهای با این ابعاد میتونه به دو شکل باشه البته فک میکنم چیزی که مهمه کنترل حرارت هستش .. تولید حرارت با استفاده از امواج ماکرو که برای موادی که حاوی اب هستند میتونه باشه که هم سرعت و هم فارگیری و ÷خش یکسانتری رو داره .. البته از معیبش تحت کنترل نیودن حرارت هستدر مقایسه با نوع المنتی که با استفاده از مقاومتهای حرارتی حرارت ایجاد و توسط سنسورهای دما کنترل میشه این دستگاه ایجاد حرارت و یا سرما به zone select شهرت دارند و تو ازماایشگاه هم برای تولید سرمایی کنترل شده و هم گرمای کنترل شده کاربرد دارند .. در مورد طراحی و ساخت ساخت محیط قابل کنترل سرد پیچیده تره ..
توکلت علی الحی الذی لا یموت
دوست آشنا
پاسخ : تکنیک های سلولی و مولکولی مورد استفاده در مراکز تحقیقاتی
blotting ( بلاتینگ)
به طور کلی در ژنتیک مولکولی به عمل انتقال مولکولهای تفکیک شده در الکتروفورز از ژل به روی یک غشاء ویژه، بلاتینگ یا بلات کردن گفته می‌شود. معنای واژهٔ انگلیسی بلاتینگ، لکه‌گذاری است.
برای انجام اعمالی مانند هیبریداسیون اسیدهای نوکلئیک و شناسایی پروتئینها با پادتن‌ها، ژل محیط مناسبی نیست. علت اصلی این مسئله نفوذپذیری کم ژل و خروج شناساگرها (Probe) از ژل می‌باشد. از اینرو در صورت انجام عمل آشکارسازی به کندی و با مشکل صورت می‌گیرد. اما غشاء، محیط مناسبی برای اعمال فوق فراهم می‌کند.
سادرن بلاتینگ:
برای انتقال مولکولهای DNA از ژل به غشاء از روشی استفاده می‌شود که سادرن بلاتینگ نام دارد (در فارسی اشتباهاً ساترن بلاتینگ هم نوشته شده). این روش ابتدا توسط ادوین سادرن از دانشگاه آکسفورد ابداع شد. در این روش از خاصیت موئینگی، برای انتقال مولکولهای DNA استفاده می‌شود. اصول این روش به این صورت است که پس از تفکیک مولکولها بر روی ژل، آن را در محلول هیدرو کسید سدیم قرار داده تا مولکولهای DNA دو رشته‌ای واسرشت شوند. درصورتیکه که ژل حاوی مواد واسرشت کننده باشد نیازی به این مرحله نیست. سپس ژل برروی سکویی که دریک ظرف حاوی بافر قرار دارد، منتقل نموده و بر روی آن غشاء نیتروسلولز قرار می‌دهند. بر روی غشاء مزبور چندین لایه کاغذ نمگیر قرار داده می‌شود. این لایه‌ها باعث برقراری جریان بافر به سمت بالا می‌شود از ژل به غشا می‌شوند. همراه با جریان بافر، مولکولهای DNA از ژل خارج شده و بر روی غشاء نیتروسلولزی یا نایلونی قرار می‌گیرند. غشاء هائی که برای این منظور به کار گرفته می‌شوند کاملاً اختصاصی بوده ودارای بار الکتریکی مثبت می‌باشند، در نتیجه مولکولهای اسید نوکلئیک به طور محکم به انها متصل می‌شوند.
نوردرن بلاتینگ:
از آنجا که RNA به سختی به کاغذهای نیتروسلولزی متصل می‌شود، از روش سادرن نمی‌توان برای مولکولهای RNA استتفاده کرد. برای انتقال مولکولهای RNA از روشی بنام نوردرن بلاتینگ استفاده می‌شود. اساس این روش مشابه روش سادرن بلاتینگ است. با این تفاوت که در آن از کاغذهای فعال شده یا کاغذهای DBM، استفاده می‌شود. این کاغذها را می‌توان به راحتی با تیمارهای شیمیایی خاصی از کاغذ صافی تهیه کرد. در این روش، به علت تک رشته‌ای بودن RNA و تفکیک آن بر روی ژل واسرشت کننده نیازی به مرحله مجاورت با هیدرکسید سدیم نمی‌باشد. در ضمن به علت حساس بودن مولکولهای RNA دقت بیشتری در انجام مراحل لازم می‌باشد.
وسترن بلاتینگ:
برای انتقال پروتئینهای تفکیک شده بر روی ژل به غشاء از تکنیک وسترن بلاتینگ استفاده می‌شود. این روش نیز مشابه روش سادرن بلاتینگ می‌باشد با این تفاوت که جریان بافر به صورت افقی است. اخیرا روشهای بلاتینگ جدیدی از ترکیب روشهای بالا ابداع شده‌اند. از جمله این روشها روش بلاتینگ جنوب غربی و بلاتینگ شمال غربی را می‌توان نام برد. روش اول برای انتقال پروتئینهایی که به DNA متصل می‌شوند استفاده می‌شود و روش دوم برای پروتئینهایی که به RNA متصل می‌شوند، به کار گرفته می‌شود.
می رسد روزی که بی من روزها را سر کنی
می رسد روزی که مرگ عشق را باور کنی
می رسد روزی که تنها در کنار عکس من
نامه های کهنه ام را مو به مو از بر کنی
کاربر جدید
پاسخ : تکنیک های سلولی و مولکولی مورد استفاده در مراکز تحقیقاتی
سلام-میشه در موردpcr-rflpکمکم کنید احتیاج به مقله دارم
دوست آشنا
پاسخ : تکنیک های سلولی و مولکولی مورد استفاده در مراکز تحقیقاتی
با سلام .دوست عزیز من در اینجا کلیات در مورد سوالی که پرسیدید میگذارم.اگر باز سوالی داشتید بپرسید.موفق باشید.
تاريخچه RFLP
RFLP اولين بار در سال 1974 به عنوان يك ماركر ژنتيكي توسطGrodzicker و همكاران براي تعيين جهش در ويروس به كار گرفته شد. استفاده ازRFLPبه عنوان ماركر بيماري ژنتيكي‌اولين بار توسطKon و Dozy (1974) براي آناليز بيماري كم خوني داسي شكل به كار گرفته شد.Botstein و همكاران 1980تئوري پايه اين روش را براي نقشه‌يابي ژنهاي مرتبط با بيماري درانسان مطرح كردند. Southern روش انتقال الگويDNA و پروب (كاوشگر) از ژل به‌غشاء نيتروسلولزي درRFLPرا ابداع كرد.
Backman (1986) براي اولين بار استفاده از اين نشانگر را مطرح نمود. كاربردهاي مهم همچون نقشه‌يابي و دستكاري مكانهاي ژنهاي كنترل كننده صفات كمي با استفاده ازRFLPدر سال1983 توسطBackman وSoller بيان گرديد. با گسترش كاربرد اين نشانگر قدرتمند چند ژن يا ژنوم‌آناليز شدند تعدادي از گونه‌هاي دام چون گاو، گوسفند، بز، اسب، خوك و جوجه نيز با استفاده از اين‌نشانگر آناليز شدند
كليات تكنيك
مشخص شده است كه ژنوم موجودات به طور طبيعي داراي تفاوتهائي در رديف بازهاي خطي مي‌باشند اين تغييرات طبيعي كه سبب گوناگوني در افراد يك جمعيت مي‌شود چند شكلي ژنتيكي‌نام دارد. اگر اين چند شكلي در رديف بازهايDNA در جايگاه شناسائي آنزيم محدودكننده ايجادشده باشند به راحتي قابل رديابي استRFLP . وجود الگوهاي غيريكسان است كه بر اثر هضم‌آنزيمي يك ناحيهِ خاص ازDNA بوسيلهِ آنزيمهاي محدود كننده مشخص مي‌شود. اين الگوهاي‌غيريكسان به علت تفاوتDNA بسته به حضور يا عدم حضور جايگاه آنزيمهاي محدود كننده‌بوجود مي‌آيد اين الگوها را به دو شكل مي‌توان مشخص كرد .
- هضم آنزيمي و سپس الكتروفوز و استفاده از لكه‌گذاري ساترن
PCR فطعه مورد نظر و هضم آنزيميRFLP مستقيما روي تظاهر ژن از طريق تغيير در شكل‌گيريmRNA و ميزان و تعداد نسخه‌برداري تاثير مي‌گذارد.
در روشRFLP ابتدا نمونه‌اي ازDNAرا با يكنوع آنزيم برشي، هضم مي‌كنند كه در نتيجه تعداد زيادي قطعه با طول متفاوت بدست مي‌آيد، سپس اين قطعات با استفاده از ژل آگارز ازهمديگر جدا مي‌شوند شناسائي وتشخيص يك قطعه‌خاص با استفاده از كاوشگرها امكانپذير است‌كه اين عمل با استفاده از تكنيك ديگري تحت عنوان لكه‌گذاري ساترن صورت مي‌گيرد
لكه‌گذاريSouthern
براي انجام عمل هيبرايداسيون لازم است كه علاوه بر قطعه كاوشگر، قطعاتDNA هضم شده نيز تك رشته‌اي شوند لذا ابتداDNA روي ژل آگارز كه حاوي قطعات هضم شده است درمحلولهاي قليائي مثل اوره يا فرمالدئيد يا هيدروكسيدسديم تك‌رشته مي‌نمايند. سپس صفحه‌اي ازغشاء نيترو سلولزي را روي قسمت فوقاني ژل قرار داده و روي آن غشاء مقداري كاغذ جاذبه الرطوبه‌مي‌گذارند محلول بافر تانك الكتروفوزر بوسيله فشار اسمزي كاغذ فوقاني بالا كشيده مي‌شود و حين‌عبور از ژل به غشاء نيترو سلولزي كه داراي بار مثبت است منتقل مي‌گردد. با تسهيل عمل‌هيبريداسيون بين كاوشكر و قطعاتDNA هضم شده در معرض پروب نشاندار راديواكتيو در نقاطي‌كه همولوژي وجود دارد هيبريد مي‌گردد. قطعاتي كه هيبريداسيون در آنها صورت نگرفته است ازمحيط شسته مي‌شوند و سپس از غشاي نيترو سلولزي در مجاورت فيلم عكاسي اتوراديوگرافي‌بعمل مي‌آيد پس از ظهور و ثبوت فيلم قطعات ويژه‌اي ازDNA كه با پروب هيبريد هستند به‌صورت يك باند مرئي ديده مي‌شود شكل زير مراحل انجام لكه‌گذاريSouthern را نشان مي‌دهد.مزايايRFLP عبارت است از موارد زير مي‌باشد:
- تحت تاءثير محيط نيست و صددرصد ژنتيكي است
- همبارز است
- تكرار پذيري آن بالاست
PCR-RFLP) PBR)
در روش دومRFLP ، ابتدا قطعه حاوي جايگاه چند شكلي را با واكنش زنجيرهِ پلي‌مراز واستفاده از دو پرايمر مخصوص كه به همين منظور طراحي شده تكثير مي‌نمايند و پس از هضم‌آنزيمي، الكتروفوز مي‌كنند. درPBR جهشهائي از نوع نقطه‌اي و حذف و اضافه كه باعث تغيير درسطح قطعه آنزيمي مي‌گردند قابل تشخيص است
فرق لكه‌گذاري ساترن وPBR
در RFLPساترن تنوعDNAدر داخل يك منطقهKb 30 محصور توسط پروب تعيين مي‌گردد در حاليكه درPBR تنوع در داخل منطقه‌اي كه از دو طرف به پرايمر ختم شده تعيين‌مي‌شود اين ناحيه معمولاKb2-0.5است. علاوه بر اين درPBRمزايائي چون سادگي، سرعت‌زياد، عدم نياز به مواد راديواكتيو و تكرارپذيري بالا مطرح مي‌باشد
ميزان پلي‌مورفيسم و تعداد آللها درPBR كمترازRFLPساترن مي‌باشد عباسي (1376)نشانگرPBRبراي تشخيص پلي‌مورفيسم در ژن هورمون رشد گاوهاي هلشتاين استفاده‌كرد Aggreyو همكاران 1999 از ماركرPBR براي تشخيص پلي مورفيسم در ناحيهِ مجاور ژن گيرنده هورمون رشد در گاوهاي هلشتاين كانادا استفاده نمودند و الگوهاي باندي مختلفي را درروي ژل مشخص نمودند
می رسد روزی که بی من روزها را سر کنی
می رسد روزی که مرگ عشق را باور کنی
می رسد روزی که تنها در کنار عکس من
نامه های کهنه ام را مو به مو از بر کنی
دوست آشنا
پاسخ : تکنیک های سلولی و مولکولی مورد استفاده در مراکز تحقیقاتی
الكتروفوز محصولات PCR یا هر نمونه از نوکلئیک اسید:
ابتدا 1 گرم پودر آگارز را برای تهیه ژل 1درصد در 100 میلی لیتر از بافر tae ریخته و حرارت داده تا شفاف شود.پس از سرد شدن ژل تا دمای 55 درجه 5 میکرولیتر از اتیدیوم بروماید
005/0به آن اضافه كرده و در ظرف مخصوص حاوی شانه ریخته می شود.بعد از بسته شدن ژل، هر 5 میكرولیتر محصول pcr یا نمونه نوکلئیک اسیدی با یک میكرولیتر لودینگ دای مخلوط نموده سپس در چاهكهای ژل قرار داده می شوند . با ولتاژ بالا حدود 100 ولت شروع تا اینكه نمونه ها از چاهك خارج شود سپس ولتاژ را به حدود 70 ولت رسانیده و سپس از یكساعت الكتروفورز نمونه ها با استفاده از دستگاه نور ماورا بنفش مورد بررسی قرار می گیرند.
می رسد روزی که بی من روزها را سر کنی
می رسد روزی که مرگ عشق را باور کنی
می رسد روزی که تنها در کنار عکس من
نامه های کهنه ام را مو به مو از بر کنی
کاربر جدید
پاسخ : تکنیک های سلولی و مولکولی مورد استفاده در مراکز تحقیقاتی
باتشکر از شما .اگه ممکنه در مورد اینکه چطوری میشه از این روش برای تعیین بیان ژن در مر حله خاصی از نمو گیاه متلأ "گلدهی" استفاده کرد توضیح بدین .
دوست آشنا
پاسخ : تکنیک های سلولی و مولکولی مورد استفاده در مراکز تحقیقاتی
برای این منظور شما باید اول RNA را از نمونه همون مرحله از نمو گیاه را استخراج کنید بعد از ساخت cDNA ، بر اساس ژن مورد نظرتون و با استفاده از پرایمر اختصاصی که برای اون ژن طراحی کردید PCR می گذارید که اگر باند داد یعنی اون ژن بیان شده.
اما یک روش جدیدتر ه برای بررسی بیان ژن های مختلف وجود داره تکنیک Microarray هست.با این تکنیک می تونید بیان هزاران ژن رو به طور همزمان بررسی کنید.در این لینک مقاله ای هست که خودم در مورد microarray نوشتم میتونید مطالعه بفرمایید.http://www.njavan.com/forum/showthread.php?t=20481
می رسد روزی که بی من روزها را سر کنی
می رسد روزی که مرگ عشق را باور کنی
می رسد روزی که تنها در کنار عکس من
نامه های کهنه ام را مو به مو از بر کنی
کاربر جدید
پاسخ : تکنیک های سلولی و مولکولی مورد استفاده در مراکز تحقیقاتی
سلام
سمینار پایان ترم من درباره ی کاربرد microarray در شناسایی میکرواورگانیسم هاست ولی من هیچ گونه اطلاعاتی نسبت به این موضوع ندارم.
میشه از شما خواهش کنم منابعی رو برای مطالعه معرفی کنید یا توضیحاتی در این باره بدید؟ ممنون میشم.
در حال حاضر 1 کاربر در حال مشاهده این موضوع است. (0 کاربران و 1 مهمان ها)
مجوز های ارسال و ویرایش
قبل از هر گونه فعالیت در سایت به قوانین توجه نمایید.
پاسخ با نقل قول
علاقه مندی ها (Bookmarks)