کلون سازی ژن

[eagleeye]

ژن کلونینگ ژن کلونینگ فرآیندی است که طی آن توالی مشخصی از DNA را جداسازی می‌کنند تا نسخه‌های یکسانی از آن را در محیط طبیعی ( سلول یا بافت زنده ) بدست آورند. هدف از ژن کلونینگ فراهم کردن نسخه‌های متعدد از یک ژن منفرد است. تکثیر یک ژن در حوزه‌های مختلف تحقیقاتی مورد استفاده است. به علاوه دارای کاربردهای پزشکی از قبیل ژن درمانی و کاربردهای صنعتی نظیر تولید مقدار زیادی از یک پروتئین می‌باشد. برای کلون کردن ژن قطعه‌ای از DNA را از موجودی به موجود دیگر منتقل می‌کنند. سلولی را که منشاDNA از آن است رادهنده و سلولی را که آن را دریافت می‌کند میزبان می‌گویند.




کلونینگ ژن به روش‌های مختلفی صورت می‌گیرد اما اساس همه‌ی آنها به این صورت است که DNA هدف از سلول دهنده استخراج می‌شود و با کمک آنزیم‌هایی برش داده می‌شود و به داخل یک مولکول DNA حلقوی، که معمولاً یک پلاسمید است و نقش ناقل (وکتور) را دارد، وارد می‌شود. به این ترتیب یک مولکول DNA نوترکیب ساخته می‌شود. در مرحله‌ی بعد DNA نوترکیب را به سلول میزبان که اغلب نوعی باکتری می‌باشد منتقل می‌کنند. این مرحله را ترنسفورماسیون می‌نامند.DNA نوترکیب در سلول میزبان همانندسازی می‌کند و همراه سلول میزبان تکثیر می‌شود. سلول‌های حاصل از تقسیم سلول میزبان اولیه، نسخه‌هایی از DNA نوترکیب همانندسازی شده را به ارث می‌برند. سلول‌های باکتری به دنبال تقسیمات متعدد کلنی تشکیل می‌دهند و از آنجا که اعضای این کلونی حاوی یک یا چند نسخه از ژن مورد نظر ما که در DNA نوترکیب حمل می‌شود می‌باشد، می‌توان گفت این ژن کلون شده است.
استخراج و برش ـ اولین گام در تولید DNA نوترکیب و سپس کلون کردن آن، استخراج و برش وکتور از سلول باکتری و DNA از سلول دهنده می‌باشد.
برای استخراج DNA از سلول دهنده، ابتدا باید عصاره‌ی سلولی تهیه کرد. برای این منظور غشای سلول را متلاشی می‌کنند تا محتویات آن خارج شود سپس مخلوط حاصل را سانتریفیوژ می‌کنند تا زوائد آن ته‌نشین شود و مایع رویی که عصاره‌ی سلولی است و حاوی DNA می‌باشد را جمع آوری می‌کنند. عصاره‌ی سلولی علاوه بر DNA حاوی پروتئین و RNA نیز می‌باشد. با یکی از روش‌های تجزیه‌ی آنزیمی پروتئین و RNA یا کروماتوگرافی تعویض یونی DNA را از عصاره‌ی سلولی تخلیص می‌کنند.
برای استخراج پلاسمید از سلول باکتری، بعد از تخلیص DNA باید پلاسمید را از DNA کرومزوم باکتری جدا کرد. برای این منظور از تکنیک اولتراسانتریفیوژ که بر مبنای شیب جرمی می‌باشد استفاده می‌کنند.
بعد از جداسازی، DNA سلول دهنده باید به قطعات کوچکتر بریده شود. برش DNA به قطعات کوچکتر را می‌توان از طرق راه‌های مختلفی انجام داد از آن جمله ایجاد شکست در DNA با استفادها از امواج صوتی ( سونیکیت )می‌باشد. در این صورت طول قطعات حاصل از یک مولکول DNA با مولکول دیگر متفاوت خواهد بود چرا که شکست مولکول DNA به صورت تصادفی صورت می‌گیرد. کشف آنزیم‌های محدود کننده (restriction enzymes) محققان را قادر ساخت تابتوانند قطعات با طول یکسان را از چندین مولکول DNA یکسان فراهم کنند. آنزیم‌های محدود کننده باکتری‌ها را قادر به دفاع در مقابل فاژها می‌کند. این آنزیم‌ها مولکولDNA را درمحل‌های ویژه‌ای باترتیب نوکلوتیدی خاصی قطع می‌کنند. بنابراین برای آنکه‌ یک مولکول DNA با این آنزیم‌ها بریده شود، وجود توالی‌های خاصی به نام جایگاه محدود کننده در مولکول DNA ضروری است و باید برای برش DNA به دنبال آنزیمی گشت که دارای بیش از ۲ جایگاه محدود کننده بر روی آن باشد.
همچنین مزیت دیگر استفاده از آنزیم‌های محدود کننده این است که می‌توان از همان آنزیم برای برش پلاسمید ناقل استفاده کرد و به این طرق امکان انطباق دو انتهای قطعه‌ی ژن هدف با دو انتهای بریده شده‌ی پلاسمید را به سادگی فراهم کرد.



منبع کتاب: کلون سازی و آنالیز DNA ، نویسنده: برون

(Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, Sixth Edition, Brown

دانلود کتاب


برگرفته از وبلاگ دامپروری "Animal Husbandry"

.:: برای اطلاعات بیشتر در این زمینه به این وبلاگ مراجعه نمایید ::.

باتشکر

گردآوری و ترجمه: مجتبی رضایی