معرفی تکنیک PCR معلق (Overhang PCR)
آیا تا به حال برای‌تان اتفاق افتاده است که فراموش کنید توالی توافقی Kozack را در ابتدای ژن رمز کننده خود قرار دهید؟ یا فراموش کنید که رمز پایان را اضافه کنید؟ آیا تا به حال بعد از اینکه ژنی را کلون کردید، متوجه شده‌اید که قرار بود برچسب خاصی را به آن اضافه کنید؟ یا بخواهید یک توالی برشی برای آنزیم محدودالاثر را به محصول PCR خود اضافه کنید تا راحت تر بتوانید آن را در پلازمید کلون کنید؟ مطمئناً PCR معلق پاسخگوی شما خواهد بود!!
PCR معلق (Overhang PCR) چیست؟
PCR معلق تکنیکی است که از اختصاصیت ذاتی انتهای ۳’ پرایمرها به یک توالی خاص استفاده می‌کند تا بتوان توالی بیشتری را به انتهای ۵’ پرایمر اضافه کرد. این کار به شما این امکان را می‌دهد تا با استفاده از PCR توالی مورد نظر را تکثیر کرده در حالی می‌توانید نوکلئوتیدهایی را به انتهاهای ۳’ یا ۵’ توالی مورد تکثیر اضافه کنید. این محصول در ادامه می‌تواند برای کلون شدن درون یک وکتور به کار رود.
این تکنیک چگونه کار می‌کند؟
پرایمرها می‌توانند به‌گونه‌ای طراحی شوند که دارای توالی معلق در انتهای ۵’ خود بوده و این توالی معلق را به یک محصول PCR وارد کنند. اولین چرخه برنامه PCR موجب می‌شود که پرایمرها در ناحیه‌ای که مکمل الگو هستند به آن متصل شده و محصولی را ایجاد کنند که ناحیه معلق موردنظر را نیز در انتهای خود داشته باشد. نهایتاً چرخه‌های بعدی این رشته از DNA را تکثیر می‌کنند تا حجم انبوهی از محصول PCR حاوی توالی DNA موردنظر داشته باشیم.
http://bionet.ir/upload/images/s9412a.jpg
روش انجام کار
۱. طراحی پرایمر
به‌صورت مطلوب حداقل نیمی از پرایمر شما باید حاوی توالی موجود در الگو باشد (البته در بعضی موارد این مقدار را تا یک سوم هم می‌توان کاهش داد) تا اطمینان داشته باشید که انتهای ۳’ پرایمر شما می‌تواند به توالی الگو متصل شود. باقی پرایمر شما می‌تواند به‌صورت معلق باشد. اگر هدف شما داشتن پرایمری در حدود ۲۵ جفت باز است این کار به‌اندازه توالی معلق شما بستگی دارد. پرایمرهایی با طول حدود ۱۰۰ جفت باز نیز در این روش قابل‌استفاده هستند.
نکته: اگر می‌خواهید توالی برش برای آنزیم محدودالاثر را در انتهای محصول PCR خود ایجاد کنید ممکن است نیاز داشته باشید تا توالی بیشتری برای داشتن برشی مناسب به پرایمر خود بی افزایید.
ازنظر خصوصیات ترمودینامیکی تنها نیاز است که دمای ذوب مناسب برای بخشی از پرایمر خود را محاسبه کنید که به الگو متصل می‌شود. شرکت‌های سازنده پرایمرها برای انجام واکنش پلیمرازی معمولاً دمای مناسب ذوب شدن برای پرایمرهای شما را مشخص می‌کنند. ناحیه معلق را در محاسبه Tm خود وارد نکنید زیرا چرخه‌های اول و دوم مهم‌ترین چرخه‌ها برای تکثیر کامل رونوشت می‌باشند.
۲٫ تنظیم برنامه و شرایط PCR
از دستورالعمل‌های شرکت سازنده برای داشتن بهترین بازده برای واکنش خود استفاده کنید. هنگامی که از الگوهای دارای پیچیدگی بسیار زیاد (supercoiled) مانند پلازمیدها یا DNA ژنومی استفاده می‌کنید، اضافه کردن DMSO می‌تواند بازده واکنش و موفقیت PCR را بسیار افزایش دهد. در مورد شرایط PCR، دستگاه را به صورتی که پیشنهاد شده است برنامه‌ریزی کرده و دمای اتصال پرایمرها را فقط برای بخشی که به الگو متصل می‌شوند محاسبه کنید. انجام واکنش را با مشاهده کردن محصول بر روی ژل آگارز با غلظت مناسب تأیید کرده و به مرحله ۳ بروید.
همانند بسیاری از فعالیت‌های آزمایشگاهی واکنش PCR ممکن است در دفعات اول موفقیت‌آمیز نباشد و نیاز است که شرایط واکنش را بهینه‌سازی کنید. پیشنهاد می‌کنیم که واکنش‌های PCR متعددی را به‌صورت همزمان با دماهایی بالاتر و پایین‌تر از دمای اتصال اولیه پرایمر خود انجام دهید. اگر هنوز نتوانستید محصول PCR خود را به دست آورید تغییر پلیمراز ممکن است مفید باشد. از آنجایی که هر پلیمراز دارای بافر با ترکیبات و پویایی (kinetics) متفاوتی هست، پلیمرازی دیگر ممکن است برای انجام واکنش PCR شما مناسب‌تر باشد. البته پیش‌بینی اینکه کدام آنزیم می‌تواند برای شما کارآمدتر باشد غیرممکن است. درنتیجه داشتن پلیمرازهای متفاوت آزمایشی برای این منظور می‌تواند بسیار کارآمد باشد.
۳٫ محصول PCR
هنگامی که با موفقیت محصول PCR خود را تکثیر کردید، باند صحیح را از ژل آگارز جدا کرده و با استفاده از روش‌های آزمایشگاهی مناسب و یا ستون تخلیص کنید. اکنون این محصول PCR می‌تواند برای اتصال به یک وکتور به کار رود. کلون کردن می‌تواند به‌وسیله ناحیه برش آنزیمی اضافه‌شده به انتهای معلق و یا با استفاده از دم پلی A و روش کلون کردن T/A انجام شود. پس از کلون کردن محصول PCR درون یک پلازمید، توصیه می‌شود که پلازمید خود را توالی یابی کنید تا مطمئن شوید توالی معلق صحیح بوده و در پلازمید وجود دارد.
