استخراج رنگیزه های فتوسنتزی اسفناج وطیف جذبی آنها
مقدمه:
کلروپلاست تمامی گیاهان عالی دارای دو نوع رنگریزه مهم میباشد که میتواند انرژی نورانی موثر فتوسنتز را جذب کند . این رنگریزه ها شامل کلروفیل ها و کارتنوئید ها میباشد.کلروفیل ها شامل a و b و کارتنوئید ها شامل قرمز- نارنجی یا زرد میباشد. کلروفیل a برای انجام فتو سنتز در تمام گیاهان عالی و جلبکها ضروری است.امروزه برای جداسازی رنگریزه ها از کروماتوگرافی استفاده میشود که به صورت های ستونی و کاغذی و یا بر روی لایه های نازک میباشد. در استخراج رنگریزه ها از محلول های متنوعی استفاده میشود که مهم ترین آنها استون ،اتر نفت و اتانول میباشد .
وسایل و مواد لازم:
اسفناج خشک-هاون-استون-تنظیف-دکانتور-اتر نفت-اتانول-نمک طعام-بشر-سه پایه- سولفات سدیم- ستون کروماتوگرافی-شکر-دستگاه اسپکتوفتومتری
شرح آزمایش:
2 گرم از برگ اسفناج را درون هاون پودر کرده و با 50cc استون مخلوط میکنیم،مخلوط را از 4 لایه تنظیف عبور میدهیم و درون یک بشر میریزیم سپس آنرا درون دکانتور میریزیم و روی آن 30cc اتر نفت و 30cc آب مقطر میریزیم به مدت 5 دقیقه بهم میزنیم و هر از چند گاهی درب دکانتور را باز میکنیم که بخار متصاعد شده آن خارج شود.محلول به 2 فاز تقسیم میشود که محلول پایینی را بیرون میریزیم و روی محلول رویی 30cc اتانول 30% میریزیم و دوباره 5 دقیقه بهم میزنیم باز 2 فاز تشکیل میشود که قسمت پایینی را دور ریخته و بر روی محلول رویی 30cc نمک طعام 10% میریزیم تا استون را جدا کند و باز 5 دقیقه بهم میزنیم دو فاز تشکیل میشود پایینی را بیرون ریخته و بر روی محلول رویی 2 گرم نمک پودر Na2So3 میریزیم تا آبگیری کامل شود محلول را درون لوله آزمایش میریزیم و سر آنرا با پارافیلم میبندیم و در یخچال میگذاریم. بعد از یک هفته محلول را درون یک بورت به عنوان ستون کروماتوگرافی میکنیم تا رنگریزه های آنرا جدا کنیم. درون ته یک بورت با قطر مناسب کمی پنبه میگذاریم و روی آن شکر پودر شده را آرام آرام میریزیم که فاز ثابت میباشد فاز ثابت باید باید به گونه ای باشد که با محلول واکنش شیمیایی ندهد. سپس با یک میله آنرا فشرده میکنیم و روی آن کاغذ صافی میگذاریم تا شکر صاف بماند باید توجه داشته باشیم تا هیچ فضای خالی بین شکر باقی نماند.سر بورت را به یک پمپ خلاء وصل میکنیم تا عمل جداسازی با سرعت بیشتری انجام شود .محلول اتر نفت را به عنوان فاز متحرک در بالای بورت میریزیم بعد از ریختن اتر نفت و روشن کردن پمپ خلاء رنگریزه ها بر اساس اندازه مولکول ها و سبک سنگینی خود در داخل کروماتوگرافی از هم جدا میشوند و لایه های مختلف رنگی را درون بورت تشکیل میدهند و به ترتیب از ستون خارج میشوند هنگام انجام کروماتوگزافی باید توجه داشته باشیم که دائما اتر نفت را از بالا اضافه کنیم تا هوا وارد ستون نگردد بعد از خارج شدن دوسری رنگریزه که به رنگ های سبز روشن و زرد میباشد ریختن اتر نفت را قطع میکنیم و این بار از محلول پروپانول برای جداسازی کلروفیل b استفاده میکنیم که به عنوان حلال برای کلروفیل b میباشد بعد از خارج شدن تمام رنگریزه ها و جداسازی آنها رنگریزه هارا به طور جداگانه درون لوله آزمایش میریزیم تا برای انجام مرحله بعد که تعیین طیف جذبی است آماده شود.
تعیین طیف جذبی:
برای انجام اسپکتوفتومتری از محلول اتر نفت به عنوان شاهد و کالیبره کردن دستگاه استفاده میکنیم. از طول موج 420 nm تا 700 nm برای تعیین طیف جذبی شروع میکنیم.
(( قسمت هایی از آموژش های استاد گرامی آقای دکتر فلاحی))
