در بخش قبلی ما تكنيك هاي كشت سلول، بافت و اندام را توضيح داديم. استفاده های اين تكنيك ها شامل تكثير انبوه گياهان از طريق كشت بافت كه نیز بطور خلاصه مطرح شده اند. اگرچه دراين بخش درباره كاربرد هاي گوناگون كشت بافت در كشاورزي را بعنوان مؤلفه هاي بيوتكنولوژي بحث نكرده ايم. همچنين ما نياز به درك اين موضوع داريم كه مهم ترين مولفه بيوتكنولوژي، مهندسي ژنتيك يا نو تركيبي ژنتيكي است.تكنولوژي DNA (rDNA) ، كه و براي بهبود گياهان زراعي بطور گسترده اي استفاده شده است. بنابراين، كشت بافت و نيز مهندسي ژنتيك مؤلفه هاي مهم بيوتكنولوژي هستند، كه کشف شده كاربردهاي گسترده اي در كشاورزي دارند.كاربردهاي بيوتكنولوژي در كشاورزي
كشت بافت
طي چند دهه گذشته، انگيزش شاياني براي استفاده از كشت بافت در برنامه هاي بهبود گياهان زراعي وجود داشته است. برخي از كاربردهاي ممكن از كشت بافت بطور خلاصه در اين بخش مطرح خواهند شد.
[I] تكثير غير جنسي (ريزازديادي)
امروزه ازدياد رویشی گياهان كشاورزي و باغباني با ارزش، با استفاده از روش هاي بخوبي شناخته شده گوناگوني امكان پذير است. تكنيك هاي كشت سلول، بافت و اندام و باززايي وابسته گياهان با اين سيستم ها بعد جديدي را به اين روش هاي سنتي افزوده است. اين تكنيك هاي تكثيري شامل كشت سلول، بافت و اندام بطور متداول با عنوان "ريزازديادي" شناخته مي شوند. در زير بعضي از مزاياي ريزازديادي نسبت به تكنيك هاي سنتي تكثير رويشي گياه وجود دارد: (і) آن (ريزازديادي) براي تكثير سريع کلون ها در كشت سلولي كاملا مناسب است. (іі) ميتواند براي بدست آوردن و تكثير نسل هاي عاري از بيماري استفاده شود. و (ііі) مي تواند اجازه تكثير غيرجنسي هيبريد هاي مشتق شده را كه نازا هستند بدهد، يعني حتي اگر تكثيررويشي در يك گياه زراعي امكان پذير نباشد، هيبريد هاي F1 نازا مي توانند رشد داده شوند. درصورتيكه نيروي بالقوه زيادي در ريزازديادي وجود دارد، و پيش از اين تعدادي از گونه ها بطور تجارتي به اين طريق تكثير شده اند، بايد سيستم های خاصی را ايجاد كرد كه اجازه ريزازديادي گياهان زراعي خاصي را بدهد. اين جنبه قبلا در فصل 5 بحث شده است. اگرچه هنگامیکه سيستم تكثيري در دسترس باشد و گياهي خاص (براي مثال گياه عاري از بيماري يا داراي محصول زياد) از گياه زراعي خاصي براي ازدياد انتخاب شده است، مراحل بعدي شامل استفاده از جوانه هاي جانبي، رئوس اندام هوايي يا هر قسمت ديگر گياه بعنوان جداكشت، مي باشد. در مورد جوانه ها، اندام های هوايي مستقيما ظاهر خواهند شد، در حاليكه در ساير قسمتهاي گياه ، جنين زايي مستقيما يا غير مستقيم دخالت خواهد داشت. جنين ها اندام هوايي رابوجود مي آورند، كه در آنها ريشه زايي را ميتواند القا شود. در جنين زايي غير مستقيم ممكن است كالوس شكل بگيرد كه ممکن است براي تشكيل جنين ها القا شود يا ممکن است كشت سوسپانسيون برای به دست آوردن محيطي كه سلولها جنين زا مي شوند و سپس مي توانند به گياهچه ها تكوين يابند، استفاده شود. امروزه گستره وسيعي از گياهان از طريق كشت سلول، بافت و اندام باززايي مي شوند (جدول1). تنها برخي از آنها براي منافع ويژه تجاري ريزازديادي استفاده مي شوند كه در جدول 2 فهرست شده اند.
جدول 1. مثال هايي از گياهان تكثير شده از طريق كشت بافت.
1. باغباني و جنگلداري
بنفشه آفريقايي، بگونيا، داودي، سياوشان، سر بره، گلوكسينيا (نوعي گياه مخصوص برزيل)، رز، درخت كائوچو، اركيدها، اوكاليپتوس، صنوبر.
نخل روغن ، مركبات، درخت خرما، جوجوبا.
- كشاورزي (گیاهان زراعی ويژه)
چغندر قند، كلم بروكلي، اسپروت، گل كلم، كاهو، اسفناج، سيب زميني شيرين.
- كشاورزي (محصولات غذايي حجیم)
داگلاس فير (نوعي گياه هميشه بهار بلندي كه در غرب امريكا مي رويد)، كاج استخري، سرخ چوب (صنوبر غول پيكر باختر ايالات متحده).
- جنگل
جدول 2. بعضي از گياهان زراعي با مزاياي ويژه در ريزازديادي
گياه زراعي كاربرد سود اقتصادي
1. مارچوبه تكثير سريع بهبود توليد و كيفيت
2. مركبات ويروس زدايي بهبود كيفيت، توليد بالا
3. قهوه مقاوم به بيماري نسل سالم تر
4. آناناس تكثير انبوه توليد بالاتر، بهبود كيفيت
5. توت فرنگي تكثير انبوه معرفي سريع نژادهاي جديد
6. اوكاليپتوس، صنوبر، تكثير انبوه پرورش حقيقي
اركيدها، نخل روغن ژنوتيپ هاي مطلوب
درصورت استفاده از ريزازديادي براي هدف تجاري، نسبت هزينه به سود بايد مورد توجه قرار بگيرد. براي مثال در انگلستان با وجود اينكه ريزازديادي نخل روغني كار بسيار مشكلي است، ماهيت و ارزش گياهان ريزازديادي شده آن چنان است كه ريزازديادي را ارزشمند مي سازد. تكثير غيرجنسي گياهاني با يكنواختي مطلوب و ويژگي هاي یکدست فراهم مي سازد به طوري كه مي توانند با قيمت بالايي فروخته شوند. در موارد اين چنيني، كالوس ممكن است القا شده و سپس در كشت سوسپانسيون نگه داشته شود، كه مي تواند براي القاي جنين زايي و باززايي گياه، هر زمان كه لازم باشد، استفاده گردد.
بمنظور كاستن هزينه ريزازديادي نصب خودكار واكنش گرها و پردازشگرهاي زيستي براي كشت بافت در مقياس عمده، گسترش مي يابد. مسلماً اين امر هزينه ريزازديادي را براي اهداف تجاري كاهش خواهد داد. حوزه ديگري از فعاليت پژوهشي قابل توجه رايج توليد دانه هاي مصنوعي، براي حفظ و انتقال جنين ها بدون خطر از دست دادن قدرت زيستي، است. اين جنبه ها بطور خلاصه در فصل 5 شرح داده شده اند.
[ІІ] تشخيص و حذف عوامل بيماريزا (ازجمله ويروس ها)
ماده گياهي كه براي تكثير يا پرورش گياه استفاده مي شود معمولا بايد عاري از هر عامل بيماريزايي باشد، به طوری که بيماريي در طي اين عمليات منتقل نشود. گاهي اوقات ممكن است عامل بيماريزا حضورداشته باشد اما ممكن است هيچ نشانه هاي از بيماري را، كه اجازه شناسايي آن را مي دهد، ايجاد نكند. كاوشگرهاي مولكولي و آنتي بادي هاي مونوكلونالي مورد استفاده براي شناسايي آنها در فصل 3 و بعداً در اين فصل بحث مي شوند. ما در اين بخش مختصرا درباره تستELISA كه در تشخيص ويروس ها، حتي زمانيكه نشانه هاي مشخص كننده ويروس وجود نداشته باشد، بسيار حساس است، بحث مي كنيم.
1. ELISA براي تشخيص ويروس هاي گياهي و جانوري. ELISA (سنجش ايمونوسوربنت وابسته به آنزيم)تكنيكي براي تشخيص ويروس است كه ميتواند هم در گياهان و هم در جانوران استفاده شود. اين تكنيك ابتدا توسط وولار و همكاران (1976) و كلارك و آدامز (1977) (سپس توسط يوشا ام. جوشي از بمبئي) ايجاد و معلوم شده است كه بسيار حساس است و ابزار قابل اطمينان براي تشخيص ويروس هاي گياهي در گستره وسيعي از ميزبان ها مي باشد. اين تكنيك شامل مراحل زير است: (і) پليت پلاستيكي ميكروتيتر(عيارسنج) با تعدادي چاهك ايجاد شده؛ (іі) سطح چاهك ها با كسري از گلبولينِ (آنتي بادي ها) يك آنتي سرم پوشانده شده است، همچنين اين كار آنتي بادي ها را ثابت مي كند؛ آنتي بادي هاي خاص بطور متداول توسط تزريق حيواني همراه با ويروس هدف ايجاد مي شوند، اما آنتي بادي هاي مونوكلونال كه از طريق هيبريدوما ( نتيجه بدست آمده از سلول هيبريد طراحي شده، سلول نرمال توليد كننده آنتي بادي تركيب شده با سلول سرطاني، تكنيكي كه در توليد آنتي بادي هاي مونوكلونال استفاده مي شود) ايجاد مي شوند، بسيار اختصاصي و ايمن هستند؛ (ііі) نمونه آزمايش شامل ويروس افزوده شده و تركيب با آنتي بادي فيكس شده اجازه انجام آزمايش را مي دهد؛ (νі) ويروس هاي تركيب نشده بوسيله شستشو حذف مي شوند؛ (ν) به آنتي بادي مخصوص نشان دار كننده آنزيم اجازه داده مي شود كه با ويروس متصل به آنتي بادي تثبيت شده تركيب شود؛ استفاده از آنزيم پروكسيداز (OD 450) يا آلكالين فسفاتاز (OD 450) بسيارمتداول است؛ (іν) پليت دوباره شسته شده و سوبستراي آنزيم افزوده مي شود؛ (ііν) سوبستراي بيرنگ بعلت فعاليت آنزيم تبديل به محصول رنگي مي شود؛ (іііν) محصول رنگي ميتواند نور مرئي را جذب كند يا توسط اسپكتروفوتومتري اندازه گيري شود؛ داده هاي اسپكتروفوتومتري معمولا توسط دستگاه نورسنجي خودكار (خواننده ELISA ناميده مي شود) تنظيم شده بر اساس طول موج مورد نياز برداشته مي شوند، 96 نمونه مي توانند در چند دقيقه خوانده شود.
تست هاي ELISA مقرون بصرفه و سريع هستند و بسهولت با اندازه گيري هاي كيفي وفق مي يابند. اين روش مخصوصا وقتيكه تعداد زيادي تست مورد نيازباشد مناسب است.اگرچه آنزيم هاي متداول براي ELISA شامل فسفاتاز، پراكسيداز و اوره آز ترب مي باشند، كه پر هزينه هستند و به راحتي در دسترس نيستند. همچنين برخي از سوبستراهاي آنها خواص سرطان زايي دارند، بطوريكه در صورت امكان بايد ازآنها اجتناب شود. از این نظر، در ICRISAT (موسسه بين المللي پژوهش گياهان زراعي براي مناطق نيمه خشك حاره اي)، واقع در پاتانچرو، كه از پني سيليناز(آنزيمي كه در باكتري ها يافت مي شود)، آنزيمي كه پني سيلين ها را به اسيدهای پني سيلوئيك تبديل مي كند، استفاده مي شود. پني سيليناز در هندوستان بسهولت در دسترس است، در حاليكه ساير آنزيم هاي مورد استفاده ممكن است بايد وارد شوند، بنابراين، روش استفاده از پني سيليناز مي تواند تبادل خارجي قابل توجهي را حفظ كند. همچنين اين تكنيك تغيير يافته مي تواند در زمينه پزشكي استفاده شود.
2. حذف ويروس و عامل بيماريزايي از طريق كشت بافت. گياهان تكثير شده از طريق رويشي اغلب كاملا به بيماري هاي ويروسي آلوده مي شوند. يك تكنيك بسيار ساده كشت راس مريستم آلودگي ويروس ها و ساير ميكروارگانيسم ها ار قبيل مايكوپلاسم ها، قارچ ها و باكتري ها را از بين مي برد. گياهان عاري از ويروس توسط اين تكنيك در بيش از 75 گونه توليد شده اند. در سيب زميني، اين تكنيك در اروپا و امریکای شمالی براي حذف آلودگي ويروسي بطور گسترده اي استفاده شده است. گياهان عاري از ويروس توليد شده در اين ويترو مبادلات بين المللي و ورود ژنوتيپ هاي بهبود يافته را تسريع ميكنند. آنها همچنين نياز به دوره هاي طولاني، گسترده، و اغلب قرنطينه را كاهش مي دهند. توليد دانه هاي مصنوعي ذخيره و حمل جنين هاي سوماتيكي عاري از بيماري را بيشتر آسان كرده است.
[ІІІ]تغيير سوماكلونال و گامتوكلونال
تغييرات خودبخودي بوجود آمده در كشت بافت بعنوان منبع غني تغييرپذيري با توان استفاده در بهبود گياهان كشاورزي بدون توسل به جهش زایی يا هيبريداسيون شناخته مي شود، كه اغلب بعنوان تنها منابع تغيير براي پرورش گياهي مورد توجه هستند شناخته شده است.اين تغيير ملاحظه شده در كشت سلول ها يا بافت هاي سوماتيكي بعنوان تغيير سوماكلونال مصطلح شده است. هرچند تغيير مشابه مي تواند در گياهان مشتق شده از طريق گامتها مثل بساك يا ميكروسپور حاصل از گياهان، ديده شود. در چنين مواردي تغيير با عنوان تغيير گامتوكلونال بيان مي شود. هر دوي اين تغييرات نيروي بالقوه سودمند براي بهبود گياهان زراعي هستند.
تغیرات مشاهده شده فوق، ممکن است در گیاهان باززایی شوند و سپس برای واریته گیاه دارای صفات دلخواه غربال شوند. گزینش ممکن است در سطح سلول برای صفاتی مانند مقاومت به علف کش های خاص، سموم قارچی، آلاینده ها، دماهای خیلی زیاد و غلظت بالای نمک بکار رود. با اینکه گزینش سلول ها در کشت ها اجازه غربال میلیون ها سلول را می دهد، اما هرگز نمی توان مطمئن بود که فنوتیپ ها ظاهر شده توسط سلول های گزینش شده توسط گیاهان کامل در طول زراعت ظاهر شوند. این امر مستلزم اینست که گیاهان باززایی شده از سلول های گزینش شده باید مجددا بازرسی شوند. نيروی بالقوه استفاده از تغییر سوماکلونال ابتدا در نیشکر نشان داده شد، هنگامی که ساب کلونال های ثابت شده کولتیواری بواسطه ویژگی های زیر مجزا شد؛ (і) مقاومت به بیماری لکه چشمی (هلمینتوسپوریوم ساكاريا)؛ (іі) مقاومت به بيماري فيجي (ويروسي) و (ііі) مقاومت به كپك كرك دار (اسكلروسپور اساكاريا). همچنين تغييرات در كشت هاي پرورش يافته از پروتوپلاست هاي مزوفيل در سيب زميني مشاهده شده است، بطور عمومي با عنوان پروتوكلون ها بيان مي شوند. اين پروتوكلون هاي بهبود يافته نشان داده شده شامل ويژگي هاي كشاورزي زير است: (і) كم كردن عادت رشد بدون كاهش در تعداد و سطح كل پهنك برگچه ها؛ (іі) بلوغ زود هنگام توبرها (ііі) كيفيت-هم شكلي اندازه توبر و شكل و پوست سفيد بدون چين و چروك؛ (vі) دوره نوري كوتاه لازم براي گل دهي همراه با افزايش ميوه؛ (v) مقاومت به زنگ اوليه (آلترناريا سولاني) و زنگ پسين (فيتوفتورا اينفستنس). همچنين تغييرات جدا شده در گرانيوم، كه خارج شدن يك كولتيوار جديد را " ول وت رز" را با ويژگي هاي گل بهتر موجب مي شود. امروزه تعداد زيادي از گونه هاي گياهي ، جايكه تغييرات سوماكلونال گزارش شده اند، شناخته شده اند. بعضي از اينها در جدول 3 فهرست شده اند. به هر حال اساس اين تغييرات هنوز ناشناخته است و جذابيت و اهميت اين حوزه اخيراً كاهش يافته است.
گونه ويژگي هاي متغير S/G
I. تك لپه اي ها
(a) آليوم ساتيوا اندازه و شكل بالب،
(b) آونا ساتيوا
پديده تغييرات گامتوكلونالي از تغييرات سوماكلونالي در روابط زير تفاوت دارد؛ (i) جهش هاي نهفته فوراً بروز خواهند كرد وقتيكه سوماكلونال ها ............. در برخي موارد اجازه بروز تفاوت ها را مي دهند. (ii) تعداد كروموزوم لازم است در گامتوكلونال هاي انتخاب شده دو برابر شود. اين تغيير گامتوكلونالي عملاً در مرتب سازي دورگه ها كاربرد دارد (بعداً در اين فصل بحث مي شود).
[VΙ] جداسازی جهش های مطلوب
کشت های سلولی توسط سیستمی که برخی خواص مفید سیستم های میکروبی برای کار تجربی را دارند تهیه می شوند، هر چند سلول های موجود درمحیط کشت در نرخ های قابل مقایسه ای تقسیم نشوند. یکی از مزایای عمده امکان غربال گری میلیون ها سلول است، جمعیتی که در گیاه کامل برای غربال گری قابل دسترس نیست.اما، در زیر محدودیت های این روش گزینش وجود دارد: (i) گزینش این ویترو می تواند فقط برای بعضی ویژگی های که توسط یک سلول منفرد بروز می کنند به کار رود و نه برای صفات پیچیده ای که به سازمان یابی سلول های بسیار تمایز یافته در اندام های یا گیاهان کامل پیچیده وابسته اند. (ii) همچنین شناخته شده است که یک صفت ( برای مثال تحمل شوری) ممکن است شامل ساز و کارهای متفاوت درگونه های گیاهی مختلف باشد گزینش را در این ویترو در یک مورد اما نه در مورد دیگر امکان پذیر می سازد.(ііі) يك صفت ممكن است در اين ويترو در سطح سلولي بيان شود اما ممکن است در گياهان كامل بيان نشود. با وجود محدوديت هاي بالا، در موارد زيادي جداسازي موفق و كاراي جهش یافته ها بدست آمده است. بعضي از اين مثال ها مطرح شده اند.
1. مقاومت به بيماري. مقاومت به بيماري اولين ويژگي كشاورزي مورد علاقه بود، به اين منظور گزينش اين ويترو با ارزش شناخته شد. براي اين منظور سلول ها در محيط كشت تکمیل شده با غلظت مرگبار سم بيماري قرار داده مي شود (اين روش فقط زماني كه سم توليد شده توسط پاتوژن نشانه هاي بيماري را توليد كند امكان پذير است)، و سلولهايي كه دوام مي آورند اجازه باززايي به گياهان كامل را دارند. اين روش عملاً در دو مورد زير استفاده شده است: (i) در تنباكو، باكتري بيماريزاي پسودوموناس تاباكي كلروز بافت برگ منتهی به بيماري به نام وايلد فاير ايجاد مي كند.متيونين سولفكسومين (MSO)، مشابه سم وايلد فاير براي انتخاب سلول هاي مقاوم استفاده مي شود، جون آن (MSO) باعث بروز نشانه هاي بيماري وايلد فاير مي شود. از سلولهايي كه مقاوم هستند مي توانند گياهان مقاوم به عمل آيند، و وقتي با گياهان طبیعی آميزش كنند، مقاومت در روش مندلي مجزا مي شود. اين گياهان نسبت به عمل سم مقاوم هستند، اما ساير اثرات زيان آور آلودگي باكتريایی را دارند به سم اکتسابی است، اما نه به پاتوژن. (іі) گزينش براي مقاومت به سم در میان سلولهای كشت شده همچنين براي به عمل آوردن گياهان مقاوم به زنگ برگ ذرت جنوبي (ایجاد شده توسط درسكسلرا مي ديس) استفاده شده است، كه با بخش نر عقيمی سيتوپلاسمي در ارتباط است. سم پاتوژن براي گزينش اسفاده مي شود، و نژاد های سلولی مقاوم جدا سازی شده و گياهان باززايي مي شوند. گياهان مقاوم نه تنها به پاتوژن مقاوم هستند بلكه نربارور دارند، چون صفت در ژنوم ميتوكندريايي است و وراثت سيتوپلاسمي دارند. اگرچه، یک هدف می تواند توليد ذرت هيبريد، مانند توليد گياهان نر عقيم مقاوم به بيماري باشد، هدفي كه نمي توان از طريق گزينش سلولها در محيط كشت به دست آورد.
2. مقاومت به علف كش ها. مقاومت به علف كش يكي از چندين عرصه ای است که در توليد گیاهان زراعي آينده مهم شناخته شده است. نژاد هاي سلولي و گياهان مقاوم براي علف كش هاي فنوكسي، پي كلرام، گلي فسات، تري آزول ها و كارباميت ها به دست آمده اند. به دست آوردن نژاد هاي سلولي مقاوم به يك علف كش نسبتاً آسان است، هر چند، گياهان مقاوم به علف كش از طريق كشت سلول تنها در چند گونه به دست آمده است. در برخی موارد ویژگی مقاومت در سطح سلولی انتقال می یابد اما در گیاه کامل باززایی شده از چنین سلول هایی بروز نمی کند. برخی اوقات، نژاد های سلولی که به یک علف کش مقاوم هستند به علف کش مرتبط یا غیر مرتبط دیگر نیز مقاوم می با شند. به عنوان مثال گیاهان تنباکو مقاوم به پیکلرام مقاومت به هیدروکسی اوره را نیز نشان می دهند. گیاهان مقاوم به علف کش همچنین با ورود ژن های بیگانه ساخته شده اند.
3. نژاد های سلولی متحمل به شوری و برودت. نژاد های سلولی متحمل به NaCl در تاتوره، کپسیکوم، مدیکاگو، نیکوتیانا و برنج ایجاد شده اند. در موارد زیادی از این نژاد های سلولی گیاهان کامل باززایی شده اند. نژادهای سلولی با افزایش تحمل سرما همچنین در نیکوتیانا سیلوستریس و دائوکوس کاروتا جدا سازی شده اند. گیاهان از سه نژاد نیکوتیانا سیلوستریس باززایی شدند اما فنوتیپ به صورت جنسی انتقال نیافت.
