مهندس شعبان
9th March 2012, 08:41 PM
آگروباکتریوم و کاربرد آن درانتقال ژن
آگروباكتريوم:
نوعی باكتري خاكزي گرم منفي است كه باعث بيماري گال تاجی در گياهان ميشود.
A.tumefaciens: آگروباكتريوم توم فاسينس- تشكيل گال طوقه
A. rhizogenes: آگروباكتريوم ريزوژنز- بيماري ريشه هاي مويي
چگونه آگروباكتريوم باعث بروز بيماري ميشود؟
تشابه ظاهري بين گال هاي توليد شده توسط آگروباكتريوم و تومورهاي حيوانات توجه دانشمندان را در سالهاي 1960 و 1970 به خود جلب كرد به اين طريق كه گال ها به مانند سرطان ميمانند؟ در نهايت دانشمندان به اين نتيجه رسيدند كه مگاپلاسميد براي بوجود آمدن بيماري ضروري است. مگاپلاسميد آگروباكتريوم تومفاسينس در نهايت به عنوان پلاسميد (القاكننده تومور) تعيين شد. به صورت مشابه مگاپلاسميد آگروباكتريوم ريزوژنز به عنوان پلاسميد شناخته ميشود. در ان زمان اين طور فرض شد كه اين پلاسميدها ممكن است به صورت فعال وارد سلولهاي ميزبان شوند اما فناوري در ان زمان به اندازه كافي پيشرفته نبود تا قطعات كوچك در ژنوم بزرگ گياه را تشخيص دهد. با بوجود آمدن تکینیک DNA نوترکیب (به عنوان مثال آنزيمهاي برشي لكه گزاري يا بلات كردن) امكان اينكه صحت فرضيه انتقال DNA بررسي شود امكان پذير شد. ثابت شده است كه تشكيل گال بستگي به فعاليت تعداد محدودي از ژنها (آنكوژنها) دارد كه برروي پلاسميد قرار دارند. اين ژنها همچنين باعث سنتز تركيبات نيتروژني غير معمول (اپين ها) در بافت گال ميشوند.
محل و چگونگي بوجود آمدن گال
آگروباكتريوم از محل زخم تازه وارد گياه ميزبان ميشود. محل زخم دو اثر مهم در كلن شدن آگروباكتريوم دارد:
1- ترشح متابوليتهاي فنولي كه آگروباكتريوم آنرا تشخيص ميدهد و با فعال كردن ژنهاي لازم براي انتقال DNA عكس العمل نشان ميدهد 2- فضايي براي فعاليت تقسيم سلولي بوجود مياورد و در همين حال محل زخم ترميم ميشود.
القاكننده هاي Vir فنولي محصول متابوليسم فنل پروپانويد هستند به نظر ميرسد كه اينها با مولكولهايي كه در استحكام مارپيچ پلي ساكاريد ديواره سلولي نقش دارند مرتبط باشند( به عنوان مثال انتقال دهنده هاي فنلي و ليگنين هاي پليمري).
القاي Vir همچنين با حضور قندهاي ساده و PH اسيدي كه هر دو آنها در اثر بروز زخم در گياه بوجود ميايد تشديد ميشود.
آگروباكتريوم بايد به صورت فيزيكي به ديواده سلولي متصل شود تا بتواند T-DNA خود را به گياه انتقال دهد. وقتي تماس اوليه بر قرار شد باكتري ها شبكه در هم پيچيده اي از فيبريل هاي سلولزي (بتا- 1-4 گلوكان) را بوجود مياورند كه كمك ميكند تا سلولها به ديواره سلولهاي گياهي متصل شوند.
جابجایی DNA:
بطورمعمول شامل يك پلاسميد بزرگ به اضافه كروموزمهاي آن ميباشد. فعاليتهاي متفاوت بيولوژيكي آنها توسط ژنهايي كه روي پلاسميد هستند ديكته ميشود.
Ti plasmid :
3 منطقه مهم براي جابحايي DNA و تشكيل غده وجود دارد: T-DNA، T-DNA Borders و منطقه Vir.
T-DNA:
دارای ژنهاي كد كننده براي بيوسنتز فيتوهورمونها(اكسين و سيتوكينين) و ژنهاي كد كننده براي سنتز اپين است که اين ژنها فقط در گياه رونويسي ميشوند.
Opin ها قندها و پروتئین های نادری هستند که T-DNA، گیاه را مجبور به ساختن آنها می کند. این مواد بعنوان منبع غذایی از کربن و نیتروژن مورد استفاده باکتری قرار می گیرند. از مهمترین انواع اپاین ها، Nopalin ها و Octopin ها هستند:
nopaline = arginine + alpha-ketoglutarate
octopine = arginine + pyruvate
mannopine = glutamine + mannose
agrocinopine A = sucrose + arabinose
:T-DNA borders
24-25 جفت باز با ترتيب تكراري در هر دو طرف T-DNAقرار دارند که به نظر مي رسد فقط طرف راست(Right Border) مهم باشد.
Vir region:
اين منطقه 35 كيلو بازي، شامل 6-9 واحد قابل رونويسي است.(VirA, B, C, D, E, F, G, H, J)
براي تشكيل گال چهار لوكوس وير قابل اهميت است(A, B, D and G) .
بعضي از محصول فعاليت ژنهاي وير در داخل سلول باكتري است ولي بعضي ديگر منتقل ميشوند و در داخل سلول ميزبان عمل ميكنند.
بيشتر ژنهاي وير در غياب سلولهاي ميزبان خاموش هستند ولی VirA و VirG به مقدار کم رونویسی می شوند. VirA و VirG به صورت يك سيستم كنترل كننده سلسله مراتب، بقيه ژنهاي وير را كنترل ميكنند.
VirA با غشائ داخلي باكتري متصل گرديده و با ژن كروموزومي ChvE یک کمپلکس تشکیل می دهد. پيوند يك ملكول فنول خاص كه با Vir A كمپلكس تشكيل ميدهد باعث فعاليت پروتئين كيناز و فسفریليزاسیون ميشود.
محصولات ژن (VirD1 and VirD2) virD به توالي سمت راست مرزي متصل شده و يك شكاف در انتهاي T-DNA بوجود مياورند. اين فعالت با محصولات ژن VirC که به توالی های مجاور متصل می شوند تشدید می شود. منبع:سایت علمی دانشجویان ایران
پروتئین VirD2 با پیوندهای کووالانسی به انتهای رشته T، در طی مراحل انتقال متصل می ماند.
پروتئین VirE2 یک پروتئین متصل به DNA تک رشته ای است که چندین کپی از آن رشته DNA را احاطه می کنند. VirE2 نیز به میزبان منتقل می شود. محصولات ژن VirB یک ساختار ترشحی نوع 4 را تشکیل میدهد که در هدایت ساختار نقش دارد.
ساير نواحي پلاسميد Tiنيز نقشهاي مهمي ايفا ميكنند:
ناحيه اتصال - توانايي اگروباكتريوم را براي تبادل پلاسميدها با ديگر سلولهاي باكتريايي كنترل ميكند كه با سيستم انتقال T-DNAمشابه است.
ناحيه كاتابوليسم اپين - پروتئينهايي را كد ميكند كه براي وارد كردن و استفاده كردن ازكلاس مشابه اپينهايي كه سنتز آنها بوسيلهT-DNA انجام می شود لازم است.
ناحيه همانند سازي پلاسميد - اجازه ميدهد تا آگروباكتريوم پلاسميدTi را طی تقسیم سلولی نگه دارد.
آگروباكتريوم:
نوعی باكتري خاكزي گرم منفي است كه باعث بيماري گال تاجی در گياهان ميشود.
A.tumefaciens: آگروباكتريوم توم فاسينس- تشكيل گال طوقه
A. rhizogenes: آگروباكتريوم ريزوژنز- بيماري ريشه هاي مويي
چگونه آگروباكتريوم باعث بروز بيماري ميشود؟
تشابه ظاهري بين گال هاي توليد شده توسط آگروباكتريوم و تومورهاي حيوانات توجه دانشمندان را در سالهاي 1960 و 1970 به خود جلب كرد به اين طريق كه گال ها به مانند سرطان ميمانند؟ در نهايت دانشمندان به اين نتيجه رسيدند كه مگاپلاسميد براي بوجود آمدن بيماري ضروري است. مگاپلاسميد آگروباكتريوم تومفاسينس در نهايت به عنوان پلاسميد (القاكننده تومور) تعيين شد. به صورت مشابه مگاپلاسميد آگروباكتريوم ريزوژنز به عنوان پلاسميد شناخته ميشود. در ان زمان اين طور فرض شد كه اين پلاسميدها ممكن است به صورت فعال وارد سلولهاي ميزبان شوند اما فناوري در ان زمان به اندازه كافي پيشرفته نبود تا قطعات كوچك در ژنوم بزرگ گياه را تشخيص دهد. با بوجود آمدن تکینیک DNA نوترکیب (به عنوان مثال آنزيمهاي برشي لكه گزاري يا بلات كردن) امكان اينكه صحت فرضيه انتقال DNA بررسي شود امكان پذير شد. ثابت شده است كه تشكيل گال بستگي به فعاليت تعداد محدودي از ژنها (آنكوژنها) دارد كه برروي پلاسميد قرار دارند. اين ژنها همچنين باعث سنتز تركيبات نيتروژني غير معمول (اپين ها) در بافت گال ميشوند.
محل و چگونگي بوجود آمدن گال
آگروباكتريوم از محل زخم تازه وارد گياه ميزبان ميشود. محل زخم دو اثر مهم در كلن شدن آگروباكتريوم دارد:
1- ترشح متابوليتهاي فنولي كه آگروباكتريوم آنرا تشخيص ميدهد و با فعال كردن ژنهاي لازم براي انتقال DNA عكس العمل نشان ميدهد 2- فضايي براي فعاليت تقسيم سلولي بوجود مياورد و در همين حال محل زخم ترميم ميشود.
القاكننده هاي Vir فنولي محصول متابوليسم فنل پروپانويد هستند به نظر ميرسد كه اينها با مولكولهايي كه در استحكام مارپيچ پلي ساكاريد ديواره سلولي نقش دارند مرتبط باشند( به عنوان مثال انتقال دهنده هاي فنلي و ليگنين هاي پليمري).
القاي Vir همچنين با حضور قندهاي ساده و PH اسيدي كه هر دو آنها در اثر بروز زخم در گياه بوجود ميايد تشديد ميشود.
آگروباكتريوم بايد به صورت فيزيكي به ديواده سلولي متصل شود تا بتواند T-DNA خود را به گياه انتقال دهد. وقتي تماس اوليه بر قرار شد باكتري ها شبكه در هم پيچيده اي از فيبريل هاي سلولزي (بتا- 1-4 گلوكان) را بوجود مياورند كه كمك ميكند تا سلولها به ديواره سلولهاي گياهي متصل شوند.
جابجایی DNA:
بطورمعمول شامل يك پلاسميد بزرگ به اضافه كروموزمهاي آن ميباشد. فعاليتهاي متفاوت بيولوژيكي آنها توسط ژنهايي كه روي پلاسميد هستند ديكته ميشود.
Ti plasmid :
3 منطقه مهم براي جابحايي DNA و تشكيل غده وجود دارد: T-DNA، T-DNA Borders و منطقه Vir.
T-DNA:
دارای ژنهاي كد كننده براي بيوسنتز فيتوهورمونها(اكسين و سيتوكينين) و ژنهاي كد كننده براي سنتز اپين است که اين ژنها فقط در گياه رونويسي ميشوند.
Opin ها قندها و پروتئین های نادری هستند که T-DNA، گیاه را مجبور به ساختن آنها می کند. این مواد بعنوان منبع غذایی از کربن و نیتروژن مورد استفاده باکتری قرار می گیرند. از مهمترین انواع اپاین ها، Nopalin ها و Octopin ها هستند:
nopaline = arginine + alpha-ketoglutarate
octopine = arginine + pyruvate
mannopine = glutamine + mannose
agrocinopine A = sucrose + arabinose
:T-DNA borders
24-25 جفت باز با ترتيب تكراري در هر دو طرف T-DNAقرار دارند که به نظر مي رسد فقط طرف راست(Right Border) مهم باشد.
Vir region:
اين منطقه 35 كيلو بازي، شامل 6-9 واحد قابل رونويسي است.(VirA, B, C, D, E, F, G, H, J)
براي تشكيل گال چهار لوكوس وير قابل اهميت است(A, B, D and G) .
بعضي از محصول فعاليت ژنهاي وير در داخل سلول باكتري است ولي بعضي ديگر منتقل ميشوند و در داخل سلول ميزبان عمل ميكنند.
بيشتر ژنهاي وير در غياب سلولهاي ميزبان خاموش هستند ولی VirA و VirG به مقدار کم رونویسی می شوند. VirA و VirG به صورت يك سيستم كنترل كننده سلسله مراتب، بقيه ژنهاي وير را كنترل ميكنند.
VirA با غشائ داخلي باكتري متصل گرديده و با ژن كروموزومي ChvE یک کمپلکس تشکیل می دهد. پيوند يك ملكول فنول خاص كه با Vir A كمپلكس تشكيل ميدهد باعث فعاليت پروتئين كيناز و فسفریليزاسیون ميشود.
محصولات ژن (VirD1 and VirD2) virD به توالي سمت راست مرزي متصل شده و يك شكاف در انتهاي T-DNA بوجود مياورند. اين فعالت با محصولات ژن VirC که به توالی های مجاور متصل می شوند تشدید می شود. منبع:سایت علمی دانشجویان ایران
پروتئین VirD2 با پیوندهای کووالانسی به انتهای رشته T، در طی مراحل انتقال متصل می ماند.
پروتئین VirE2 یک پروتئین متصل به DNA تک رشته ای است که چندین کپی از آن رشته DNA را احاطه می کنند. VirE2 نیز به میزبان منتقل می شود. محصولات ژن VirB یک ساختار ترشحی نوع 4 را تشکیل میدهد که در هدایت ساختار نقش دارد.
ساير نواحي پلاسميد Tiنيز نقشهاي مهمي ايفا ميكنند:
ناحيه اتصال - توانايي اگروباكتريوم را براي تبادل پلاسميدها با ديگر سلولهاي باكتريايي كنترل ميكند كه با سيستم انتقال T-DNAمشابه است.
ناحيه كاتابوليسم اپين - پروتئينهايي را كد ميكند كه براي وارد كردن و استفاده كردن ازكلاس مشابه اپينهايي كه سنتز آنها بوسيلهT-DNA انجام می شود لازم است.
ناحيه همانند سازي پلاسميد - اجازه ميدهد تا آگروباكتريوم پلاسميدTi را طی تقسیم سلولی نگه دارد.